His标签作用-标签蛋白纯化原理与步骤

His标签是一种常用于蛋白质纯化和生物学研究的技术。它涉及将一串组成由组氨酸（Histidine）的短肽序列融合到目标蛋白的N端或C端，以便于后续的纯化和检测。本文将介绍His标签的基本概念、序列、纯化原理与步骤、应用，以及常见问题及优化策略。

 

 

一、His标签是什么？

His标签是一种由六个连续的组氨酸（His）残基组成的短肽序列，通常表示为His6标签。该标签可通过基因工程方法融合到目标蛋白的N端或C端，使其在表达和纯化过程中易于识别和捕获。

 

 

二、His标签序列

 

除了常见的His6标签外，也存在一些His标签的变体，包括：

 

1. His4标签：由四个连续的组氨酸残基组成，表示为HHHH。用于某些对标签长度敏感的应用。

2. His8标签：由八个连续的组氨酸残基组成，表示为HHHHHHHH。增加了与金属亲和介质的结合强度。

3. His标签结合其他序列：在His标签两端添加额外的氨基酸序列，以提高表达水平、溶解性或特异性。

 

在设计His标签时，需要考虑以下因素：

 

1. 标签长度：选择合适长度的His标签以平衡亲和力和对蛋白功能的影响。

2. 标签位置：根据目标蛋白的特性和功能域选择标签的位置。

3. 额外序列：根据需要添加额外的氨基酸序列，以优化表达、溶解性和纯化效果。

 

 

三、His标签蛋白纯化原理与步骤

 

原理：

 

1.金属离子亲和层析（IMAC）

His标签蛋白纯化的核心原理是基于金属离子亲和层析（Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography, IMAC）。这种方法利用His标签与特定金属离子（如镍Ni2+、钴Co2+、铜Cu2+等）之间的亲和作用来纯化带有His标签的蛋白。

 

2.亲和机制

金属离子的选择：金属离子被固定在层析介质（如树脂或磁珠）上，通常使用Ni2+或Co2+，因为这些离子与His标签的结合亲和力较强。

His标签与金属离子的结合：His标签中的组氨酸残基可以通过其侧链的氮原子与金属离子配位结合，形成稳定的复合物。

特异性吸附：带有His标签的蛋白在通过含有金属离子的层析柱时，会特异性地结合到柱上，而未标记的蛋白和其他杂质则不会被吸附。

 

3.洗脱原理

亚甲蓝酸洗脱：亚甲蓝酸（imidazole）是一种常用的洗脱剂，其结构类似于组氨酸的侧链。通过增加洗脱缓冲液中的亚甲蓝酸浓度，可以与金属离子竞争结合位点，从而使结合的His标签蛋白从柱上解吸并洗脱下来。

pH和温度调节：在某些情况下，也可以通过调节pH值或温度来改变His标签与金属离子的结合强度，从而实现蛋白的洗脱。

 

4.纯化效果评估

蛋白纯度和产率：纯化后的蛋白通常通过SDS-PAGE、印迹（Western blot）或质谱等方法进行分析，以评估纯度和产率。

生物活性检测：对于具有生物活性的蛋白，还需要通过相应的生物学实验来验证其活性的保留情况。

 

步骤	描述
细胞裂解	使用裂解缓冲液破碎表达目标蛋白的细胞，释放蛋白至溶液中。可采用超声、高压均质或化学裂解等方法。
清除裂解物	通过离心或过滤去除细胞碎片和未裂解的细胞，获取清澈的裂解液。
蛋白结合	将含有目标蛋白的裂解液通过装有Ni-NTA或Co-NTA树脂的亲和层析柱。His标签蛋白会特异性地结合到柱上的金属离子。
洗涤	使用含有低浓度亚甲蓝酸（imidazole）的缓冲液洗涤柱，去除非特异性结合的蛋白。
洗脱	使用含有高浓度亚甲蓝酸的缓冲液洗脱结合在柱上的His标签蛋白。收集洗脱液中的目标蛋白。
纯化和浓缩	如有需要，可通过进一步的层析、透析或超滤等方法对蛋白进行纯化和浓缩。
蛋白质鉴定	通过SDS-PAGE、质谱或免疫检测等方法验证蛋白质的纯度和身份。

 

 

四、His标签应用

 

His标签在生物学研究中有广泛的应用，包括：

 

1. 蛋白质纯化：用于快速、高效地纯化重组蛋白。

2. 蛋白质相互作用研究：用于检测蛋白质之间的相互作用和复合物形成。

3. 酶活性分析：用于纯化酶类蛋白，并进行活性和动力学分析。

4. 结构生物学：用于获得高纯度蛋白以进行晶体学或NMR结构解析。

5. 诊断和治疗：用于开发蛋白质药物和生物标记物。

 

五、His标签纯化常见问题及优化策略

 

常见问题

 

1.蛋白降解：

 

问题：目标蛋白在表达或纯化过程中发生降解，导致产量低和纯度差。

解决策略：使用蛋白酶抑制剂混合物，降低温度，缩短裂解和纯化时间。

 

2.非特异性结合：

 

问题：非目标蛋白与亲和介质非特异性结合，影响目标蛋白的纯化效果。

解决策略：优化洗涤条件，如增加洗涤步骤，调整亚甲蓝酸浓度，使用更高特异性的亲和介质。

 

3.蛋白失活：

 

问题：纯化过程中目标蛋白失去生物活性。

解决策略：优化缓冲液的pH和离子强度，添加稳定剂或辅因子，减少机械搅拌和氧化应激。

 

4.金属离子污染：

 

问题：金属离子从树脂上脱落，污染蛋白样品。

解决策略：使用高纯度的亲和介质，定期更换柱材料，采用金属离子螯合剂。

 

5.低结合效率：

 

问题：目标蛋白与亲和介质的结合效率低。

解决策略：优化表达水平和纯化条件，增加His标签的长度，改进蛋白的可溶性。

 

6.目标蛋白回收率低：

 

问题：洗脱步骤中目标蛋白的回收率低。

解决策略：优化洗脱缓冲液的组成，逐步增加洗脱剂的浓度，采用分步洗脱策略。

 

 

六、优化策略

 

1. 表达水平优化：改进表达载体和宿主系统，增强目标蛋白的表达水平和溶解性。

2. 裂解条件优化：选择合适的裂解方法和缓冲液成分，减少蛋白降解和非特异性结合。

3. 层析条件优化：根据目标蛋白的特性调整亲和层析的条件，如pH值、离子强度和温度。

4. 洗脱策略优化：根据目标蛋白与亲和介质的结合强度调整洗脱缓冲液的组成和浓度。

5. 后处理优化：采用适当的后处理方法，如透析、超滤或再次层析，以提高蛋白的纯度和稳定性。