干货分享 | 单抗药物电荷异构体分析和表征（三）

如前文所述，虽然单抗药物电荷变异体的检测和表征对于分析人员来说充满了挑战，但研究的最终目的还是在于探讨抗体电荷变体的生成原因，从而提升对产品和工艺的理解，进一步优化工艺、提高和控制产品质量。

首先，不能忽视的成分是主峰组分。主峰组分是产品中含量最高，最常见的成分，但其并不是完全无修饰或者无截短的完整抗体分子。研究表明，抗体分子重链C末端大都以脯氨酸甘氨酸赖氨酸的氨基酸序列结尾。其中末端的赖氨酸会在细胞培养过程中被胞内外的碱性羧肽酶切除，暴露出倒数第二个氨基酸甘氨酸，即赖氨酸截断修饰。还有，常见于N末端为谷氨酰胺的单抗分子中，其N末端谷氨酰胺发生焦谷氨酸环化修饰。这两类修饰，离单抗药物CDR区较远，一般对抗体的生物活性影响较小。此外，Fc区保守N糖位点的中性糖修饰也是主峰成分中常见的修饰，这些修饰对抗体的ADCC/ADCP、CDC以及稳定性产生影响。

其次，酸性电荷变异体的形成主要是由于天冬酰胺的去酰胺化、赖氨酸的糖化、三硫键的形成以及糖基化中的唾液酸等原因。由于产生酸性组分的修饰通常影响免疫原性、稳定性、结合活性、导致聚集等，产生不良结果的风险较高，所以酸性组分的成分和含量需要特别专注和研究。

再次，碱性电荷变体的形成则主要是由于C末端赖氨酸的切除不完全、N末端焦谷氨酸环化不完全、天冬氨酸的异构化以及脯氨酸的酰胺化等原因，一般对于单抗药物的有效性和安全性影响较小。当C末端赖氨酸被切除后，暴露出来的甘氨酸以及脯氨酸又会在另一种酶系的催化下发生甘氨酸的切除和脯氨酸的酰胺化。这个过程同样会导致碱性电荷变体的生成。

Du Y, Walsh A, Ehrick R, Xu W, May K, Liu H. Chromatographic analysis of the acidic and basic species of recombinant monoclonal antibodies. MAbs. 2012 Sep-Oct;4(5):578-85. doi: 10.4161/mabs.21328. Epub 2012 Jul 23. PMID: 22820257; PMCID: PMC3499298.

特别值得注意的是，天冬酰胺的去酰胺化（Deamidation）和天冬氨酸的异构化（Isomerization）是两种常见的导致电荷变体生成的反应。天冬酰胺的去酰胺化是一个自发进行的降解反应，它的存在会导致酸性电荷变体的形成。在中性或碱性pH条件下，天冬酰胺的去酰胺化过程通过形成一个五基团环状的中间体琥珀酰亚胺而进行。而在酸性pH条件下，天冬酰胺的去酰胺化过程则主要通过直接水解侧链上的氨基而进行。与天冬酰胺的去酰胺化不同，天冬氨酸的异构化则是一个可逆反应，它会导致抗体碱性变体的形成。

Vlasak J, Bussat MC, Wang S, Wagner-Rousset E, Schaefer M, Klinguer-Hamour C, Kirchmeier M, Corvaïa N, Ionescu R, Beck A. Identification and characterization of asparagine deamidation in the light chain CDR1 of a humanized IgG1 antibody. Anal Biochem. 2009 Sep 15;392(2):145-54. doi: 10.1016/j.ab.2009.05.043. Epub 2009 Jun 2. PMID: 19497295.

还有常见的氧化修饰一般认为会产生碱性组分，但Valliere-Douglass J等研究发现，将收集纯化的酸性组分用疏水色谱（HIC）进行分离时，其保留时间早于主峰成分，与氧化组分的保留时间一致。经分子量和液质肽谱鉴定，酸性组分中同样含有氧化修饰。由此可见，氧化修饰影响的是构象，并不是酸碱性基团直接的增加。而构象的改变带来的与色谱柱之间的结合情况是视具体情况而定的。

Valliere-Douglass J, Wallace A, Balland A. Separation of populations of antibody variants by fine tuning of hydrophobic-interaction chromatography operating conditions. J Chromatogr A. 2008 Dec 19;1214(1-2):81-9. doi: 10.1016/j.chroma.2008.10.078. Epub 2008 Oct 25. PMID: 19012891.

此外，工艺或包材中残留的杂质也有机会于蛋白发生化学修饰，产生电荷变异体。比如，环氧乙烷 (EtO) 广泛用于药品容器和医疗器械的灭菌。生物制药行业对残留 EtO 对蛋白质治疗的影响非常感兴趣。Louise Chen等发现EtO在灭菌装置中残留，可以和生物制品的甲硫氨酸和半胱氨酸的自由巯基发生反应，产生碱性组分。通过液质肽谱检测，发现该化学修饰可使肽段分子量增加约44Da，而修饰后肽段母离子在二级质谱的碰撞碎裂中易发生-92Da的中性丢失，对修饰的碎片离子鉴别造成一定困扰。

Chen L, Sloey C, Zhang Z, Bondarenko PV, Kim H, Ren D, Kanapuram S. Chemical modifications of therapeutic proteins induced by residual ethylene oxide. J Pharm Sci. 2015 Feb;104(2):731-9. doi: 10.1002/jps.24257. Epub 2014 Nov 18. PMID: 25407640.

总的来说，抗体电荷变体的生成是一个复杂的过程，涉及多种反应和因素。这些电荷变体不仅影响抗体的稳定性和药效，也给药物研发带来了许多挑战。因此，在抗体药物的研发过程中，我们需要充分了解和控制抗体电荷变体的生成，以确保药物的有效性和安全性。同时，我们也需要不断发展和完善抗体电荷变体的分析方法，以更好地表征和控制这些重要的质量属性。