项目文章Advanced Science | 中科大单革教授团队揭秘哺乳动物体内神秘环状RNA ，掌控肝细胞癌转移与脂质代谢的奥秘

肝癌组织临床标本、C57BL/6J系小鼠、ICR系小鼠

研究人员对6例HCC标本进行RNA-seq检测，得出circLARP1B是差异表达最大的，也是唯一表达上调circRNA，并且在人和小鼠中高度保守，由La核糖核蛋白1B（LARP1B）基因的外显子2-4组成。

从NCBI和CircAtlas数据库分析中得出，circLARP1B和LARP1B在人体组织中表现出不同的表达模式，揭示了LARP1B mRNA可能不是HCC的关键调控因子；转移性HCC标本中circLARP1B水平高于非转移性标本，且较高水平的circLARP1B与肿瘤转移转移、肿瘤进展以及生存率低密切相关（图1）。综上所述，circLARP1B作为一种哺乳动物保守的circRNA可能在HCC转移中发挥促进作用。

研究人员通过获得circLARP1B缺陷（circLARP1B-Def）PLC细胞，来研究circLARP1B细胞的功能；结果显示，与野生型（WT）PLC细胞相比，circLARP1B-Def PLC细胞的circLARP1B水平显著降低，而LARP1B  mRNA水平无变化，但侵袭能力较WT-PLC细胞却显著降低；通过液相色谱-质谱（LC-MS）非靶向代谢组学评估了circLARP1B-Def PLC细胞中潜在的代谢改变。在6种受到显著影响的代谢途径中，脂质代谢受到的干扰最大；接下来，研究人员进行脂质组学来检测脂质组成，检测到24种失调脂类；为了进一步探索circLARP1B促进脂质积累的机制，研究人员用¹³C标记的代谢流实验，评估了缺陷型细胞和野生型细胞中的脂质代谢情况。结果分析显示，共检测到17种具有¹³C标记的脂肪酸，且均在circLARP1B-Def细胞中显著降低，表明circLARP1B对脂肪酸合成（FAS）有促进作用（图2）。综上所述，circLARP1B促进了细胞的脂质积累。

研究人员通过检测circLARP1B潜在的相互作用分子来阐明其作用机制，AGO2的RNA免疫沉淀（RIP）分析揭示circLARP1B具有有限的miRNA结合能力。此外，circLARP1B具有有限的蛋白翻译能力；接下来，研究人员使用生物素探针，筛选出circLARP1的互作蛋白——HNRNPD；通过绘制circLARP1B中HNRNPD的结合位点，发现circLARP1B中基序1或基序2的突变降低了两者之间的相互作用，而两个基序的双突变则直接消除了相互作用（图3）。综上所述，具有两个功能位点的circLARP1B可以与大量的细胞质HNRNPD相互作用，但是circLARP1B和HNRNPD不相互调节对方的表达或稳定性。

研究人员研究了HNRNPD结合在circLARP1B功能中的作用，发现过表达circLARP1B可以挽救circLARP1B-Def细胞被抑制的细胞侵袭和LD形成，而HNRNPD的过表达抑制了细胞侵袭和LD的形成。与HNRNPD一起过表达circLARP1B可阻断HNRNPD对细胞侵袭、LD形成以及p-AmpK和p-Acc1水平的影响（图4）。综上所述，circLARP1B可能通过结合和调节HNRNPD来发挥作用。

研究人员通过对内源性表达的HNRNPD进行RIP并进行 RNA-seq，结果显示mRNA靶标上的分布主要显示在3‘UTR，这与HNRNPD的功能作用一致，而circLARP1B与该蛋白的结合能力相对较弱；此外，还发现circLARP1B缺失会促进HNRNPD结合LKB1，而circLARP1B过表达则相反。过表达的LKB1阻断了circLARP1B促进细胞侵袭和LD形成的作用，也几乎消除了circLARP1B对p-AmpK和p-Acc1水平的影响。与非转移性HCC标本相比，转移性HCC标本中的LKB1蛋白水平较低。（图5）。综上所述，LKB1 mRNA是circLARP1B的下游靶点，二者的功能作用相反。

研究人员用siRNA敲除HNRNPD后，PLC和Hepa1-6细胞中LKB1 mRNA的半衰期和LKB1蛋白水平均显著降低，表明HNRNPD正向调控LKB1 mRNA稳定。而在circLARP1B敲低却能增加LKB1 mRNA的稳定性和蛋白水平，过表达则相反。综上所述，circLARP1B虽然不影响HNRNPD表达，但会抑制LKB1表达，具体机制在于circLARP1B可以阻断HNRNPD对LKB1基因稳定的促进作用。

研究人员使用CRISPR/Cas9技术建立circLARP1B缺陷小鼠（circLARP1B^−/−）模型，缺陷型小鼠肝脏中CircLARP1B的表达显著降低，而Larp1b的总水平和新生水平没有改变；通过油红O染色检测发现，缺陷型小鼠肝脏中的LDs显著降低，而p-Ampk和p-Acc1的蛋白水平显著升高（图7）。综上所述，circLARP1B表达水平与肝脏生理状态有关。

研究人员为了在机体水平上研究CircLARP1B在HCC中的生理作用，使用二乙基亚硝胺(DEN)诱导小鼠HCC，在DEN诱导18周后（HCC），与WT小鼠相比，circLARP1B^−/−小鼠的肝脏肿瘤结节更少、更小，肺转移结节也明显更小，抗转移标志物e-钙粘蛋白升高。在circLARP1B^−/−HCC小鼠中，与HCC相关的生物标志物均有降低（图8）。上述证据表明，敲低circLARP1B水平能够抑制HCC脂质积累和转移。

circLARP1B^−/−HCC小鼠模型显示，敲低Lkb1可诱发HCC，表现为促进肝肿瘤增生和肺淋巴结转移及Vim水平升高，e-钙粘蛋白升高降低，与WT的HCC小鼠一致。研究人员在circLARP1B^−/−HCC小鼠肝脏中观察到p-Ampk和p-pAcc1水平的升高，而这种情况在Lkb1被敲除后也被根除（图9）。这些结果揭示了Lkb1作为关键因子参与肝细胞中circLARP1B介导HCC脂质代谢和转移过程。

在研究人员收集到的临床标本中，其中23例转移性肝癌标本中HNRNPD表达水平显著升高，肿瘤中LKB1 mRNA表达水平较高的肝癌患者的OS和DFS显著延长，而转移性和非转移性肿瘤组织中LKB1 mRNA表达水平无统计学差异（图10）。据此可推断出，上游机制可能上调HNRNPD和circLARP1B在转移性肝癌中的表达，而LKB1是circLARP1B在HCC中作用的关键靶点。