JIPB |跟着顶刊挖基因!华中农业大学揭示影响柑橘矮化和果实着色的转录调控网络

通过外表形态和11个酸橙基因型的系统发育树发现，短节间酸橙（SISO）和成都酸橙（CDSO）的基因型相似却存在巨大的表型差异。SISO表现出明显的矮化和匍匐生长习性，其幼苗下胚轴、节间长度、节间的纵向薄壁细胞大小、节间的细胞数目明显小于CDSO。

对SISO和CDSO的下胚轴样本进行RNA-seq，通过差异分析和差异基因GO富集发现差异基因主要与“光响应、次生代谢、芽发育和赤霉素信号通路”相关。已有文献研究发现HY5可正向调节植物矮化和下胚轴缩短，且本研究也发现SISO中的HY5含量显著高于CDSO。随后，利用基因共表达分析，发现转录因子BBX22无论是在表达趋势还是在下胚轴的表达丰度上均与HY5存在高度的共表达模式，初步认为BBX22和HY5都是调节柑橘节间伸长的候选调节因子。

构建BBX22缺失突变（bbx22）和BBX22异源过表达（BBX22-OE）。表型观测发现，与野生型相比，BBX22缺失会时柑橘节间伸长和株高增加，而BBX22过表达导致柑橘节间缩短和矮化。

为确定BBX22潜在靶点，对bbx22、BBX22-OE、野生型样本的顶端分生组织进行RNA-seq。以野生型为对照，寻找在BBX22缺失和过表达样本中重叠且变化相反的基因进行GO富集，结果指向“植物发育、次级代谢（黄酮醇和类胡萝卜素）、激素代谢（油菜素类固醇、吲哚丁酸、脱落酸、赤霉素）过程”。其中与激素相关的基因，其编码的赤霉素2-氧化酶8（GA2ox8）在bbx22中表达量更高而在BBX22-OE中表达量更低，猜测该酶是BBX22介导GA分解代谢和抑制节间伸长的潜在靶标。凝胶迁移实验（EMSA）和荧光素酶互补实验（LUC）证实BBX22和HY5均可直接与GA2ox8启动子中的G-box元件结合。同时，BBX22也可与HY5启动子结合，作为HY5的辅因子激活GA分解代谢途径，降低GA₃含量，抑制节间伸长并降低株高。外源喷施赤霉素可打破BBX22和HY5节间伸长和株高的抑制作用。

果实色泽观察发现相比于野生型柑橘，BBX22缺失（bbx22）会导致果实颜色更青。进一步测量果实中的类胡萝卜素含量和顶芽分生组织中的花青素含量，发现这两种物质均在bbx22中的积累量较低，在BBX22-OE果实中含量更高。该现象在番茄样本中得到证实，BBX22-OE番茄果实的颜色更深红，RT-qPCR实验同样证实BBX22-OE番茄植株中关键类胡萝卜素途径基因（PSY1和PDS1）、花青素合成基因（ANT1、F3’H、DFR、ANS）的表达显著高于野生型。血橙果实的RNA-seq结果表明，BBX22与PSY1和Ruby1存在共表达模式。EMSA和LUS实验表明，BBX22和HY5直接与PSY1启动子和PDS1启动子结合，激活PSY1和PDS1的转录促进类胡萝卜素的积累，还可与Ruby1、F3’H、DFR启动子激活这些基因的转录，促进花青素的积累。与BBX22相比，HY5对上述靶基因显示出更强的结合亲和力。

该文从表型出发，探讨导致柑橘矮化和果实色素沉积的转录调控过程。通过“表型观测+转录组+GA₃、类胡萝卜素、花青素含量测定+实验验证”发现BBX22不仅可与GA2ox8结合，抑制赤霉素3（GA₃）的合成使得柑橘矮化，还可与PSY1和Ruby1启动子结合，激活PSY1和Ruby1的转录，增加柑橘果实的类胡萝卜素和花青素积累，促进果实色素沉着。同时， BBX22和HY5可分别独立调节上述过程，BBY22作为HY5的辅因子完成上述的调控。整体研究发现一个新的“转录级联调控网络”。

在果实品质研究中，基因对代谢物的调控并非仅集中在一种或一类型的代谢物上。同理，农艺性状的形成也是由多种代谢物共同决定（如代谢物的种类和含量），精准定性定量这些代谢物的表达对揭示基因调控网络和农艺性状的代谢特征具有关键作用！