New Phytologist | 跟着顶刊挖机制！浙江大学揭示草莓成熟过程中脱落酸分解和蛋白磷酸化的调节机制
2025-06-10
中科新生命
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“转录组+代谢组”已成为初探调控植物代谢性状潜在分子机制的经典研究模式，而当其逐渐演变为一种“套路”时，如何发现新的调控靶点，则需要各位研究者加深分子机制验证或者补充新组学，以从其它层面使分子机制更为立体。
今天跟大家分享一篇浙江大学团队发表在植物科学领域权威期刊New Phytologist 上的题为“Phosphorylation of the strawberry MADS-box CMB1 regulates ripening via the catabolism of abscisic acid”的研究性文章，该研究揭示了蛋白质磷酸化等翻译后修饰过程调控草莓成熟的机制。文章详细阐明了转录因子的磷酸化会降低其本身的转录活性，抑制其对下游基因的结合过程，促进脱落酸（ABA）积累进而促进果实成熟。该文也是基于先前的“转录+代谢”研究基础上增加了磷酸化修饰蛋白质组，又发了一篇顶刊！
主要结论
结论1：转录因子FaCMB1是草莓果实成熟的负调控因子，可延迟草莓成熟；
结论2：FaCMB1与FaASR结合以抑制FaASR转录活性，进而延迟草莓成熟；
结论3：FaCMB1与FaASR结合，降低FaASR对FaCYP707A4的抑制过程，促进ABA分解，进而延迟草莓成熟；
结论4：FaCMB1磷酸化缺失则会激活其对FaASR的转录抑制，进而上调FaCYP707A4，降低ABA含量，抑制草莓成熟。
研究结果
1. 鉴定候选MADS-box转录因子--FaCMB1
文章基于先前的研究基础发现FaCMB1主要在草莓生殖器官中表达，且随发育过程延长表达量逐渐降低（图1a-c）。亚细胞定位和免疫印迹结果表明，该基因位于细胞核中且蛋白表达水平随果实成熟而逐渐降低（图1d）。外源施加脱落酸（ABA）会抑制FaCMB1转录本（图1e,f），暗示FaCMB1可能是草莓成熟的负调节因子。
图1 FaCMB1表达与草莓果实成熟密切相关
2. 生理实验证明FaCMB1可延迟草莓果实成熟
构建FaCMB1过表达和沉默体系，分析对照组、FaCMB1过表达组、FaCMB1沉默组中果实成熟表型特征、FaCMB1转录本和蛋白质丰度、ABA含量、果实成熟分子特征（果糖、葡萄糖、蔗糖、柠檬酸），发现FaCMB1过表达会抑制果实成熟、增加FaCMB1转录本和蛋白质水平、降低ABA含量、降低果糖、葡萄糖、蔗糖含量，增加柠檬酸含量，FaCMB1沉默会呈现相反现象（图2a-f）。再次表明，FaCMB1可抑制草莓果实成熟。
图2 FaCMB1抑制草莓果实成熟并影响质量相关性状的发育
3. 转录组结合实验确定FaCMB1抑制果实成熟的关键转录因子--FaASR
对FaCMB1沉默和对照组果实进行RNA-seq，发现与ABA信号通路相关的转录因子---FaASR在FaCMB1沉默果实中显著上调表达（图3a）。该转录因子与FaCMB1表达成负相关，与果实成熟呈正相关。对FaASR同样进行瞬时过表达和沉默实验，发现FaASR沉默的果实成熟缓慢，而过表达可加速果实成熟（图3c,d）。
图 3 FaASR沉默可抑制草莓果实成熟
为进一步阐明FaCMB1和FaASR之间的相互作用，使用双荧光素酶报告基因测定（图4a）、ChIP-定量聚合酶链反应（图4b)、EMSA（图4c），发现FaCMB1与FaASR启动子结合，降低FaASR转录活性，降低果实中ABA含量（图4d）。
图4 FaCMB1与FaASR相互作用，降低ABA含量
进一步剖析FaASR表达与ABA含量间的关联，再次检索ABA相关基因表达水平，发现ABA 分解基因---8’羟化酶FaCYP707A4在FaASR沉默果实中被显著诱导（图5a）。FaASR存在会抑制FaCYP707A4启动子活性，FaASR沉默则会激活FaCYP707A4启动子活性（图5b），降低ABA含量。因此，整体转录级联调控机制为：FaCMB1会抑制FaASR表达，激活与FaASR结合的FaCYP707A4启动子的转录活性，导致更多的ABA 8’羟化酶活性，降低ABA含量以延缓成熟。
图5 FaCMB1-FaASR-FaCYP707A4 级联反应调节草莓果实的成熟
4. FaCMB1与FabHLH3竞争性结合FaMYB10以抑制花青素生物合成
为进一步表征FaCMB1的辅因子，通过酵母双杂交测定（Y2H）、双分子荧光互补实验（BiFC）和荧光素酶互补实验（LCI）发现FaCMB1可与FaMYB10相互结合调控花青素合成（图6a-c）。LCI实验表明，FaCMB1是一种控制花青素生物合成的被动抑制因子，其调节模式依赖于与FabHLH3竞争结合FaMYB10，从而负向调节花青素生物合成基因的表达。
图6 FaCMB1与FaMYB10相互作用并减弱FaMYB10-FabHLH3对花青素生物合成基因的转录激活
5. 磷酸化位点鉴定发现FaCMB1与FaSTPK相互作用并被FaSTPK磷酸化
磷酸化在转录因子的生物功能中具有关键调节作用，作者通过Y2H文库筛选发现FaSTPK与FaCMB1存在相互作用，BiFC、LCI、GST沉降实验均证明该现象（图7a-d）。使用[γ‐32P]ATP进行体外激酶测定，发现FaSTPK可直接磷酸化FaCMB1（图7e）。对FaCMB1蛋白磷酸化位点进行鉴定，发现其被修饰的位点主要在Thr65、Ser74、Ser133、Ser134、Ser140、Thr141位点中（图7f）。
图7 FaCMB1 在特定位点与FaSTPK发生物理相互作用并被磷酸化
6. FaCMB1的磷酸化可降低其对FaASR的抑制过程，促进FaASR转录活性
为揭示FaSTPK介导的磷酸化对FaCMB1蛋白功能的影响，利用双荧光素酶测定比较不同磷酸化形式的FaCMB1的转录调控能力，发现FaCMB1磷酸化会抑制其与FaASR启动子的结合，降低对FaASR的抑制能力。同时，FaCMB1的磷酸化不会改变其与FaMYB10之间的相互作用。
图 8 BFaSTPK介导的磷酸化可减轻FaCMB1的转录抑制
7. FaCMB1的磷酸化可影响草莓果实的转录活性进而调节果实成熟
为确定FaCMB1磷酸化在草莓果实成熟过程中的生物学功能，通过qPCR和免疫印迹分别分析FaCMB1的转录水平和蛋白磷酸化水平，发现两者均随着果实的成熟而逐渐增加（图9a,b）。构建FaCMB1-GFP、FaCMB16A-GFP（FaCMB1磷酸化缺陷型）和FaCMB16D-GFP（FaCMB1磷酸化型）瞬时过表达体系，发现与对照组（EV-OE）相比，FaCMB1-GFP、FaCMB16A-GFP过表达可显著抑制果实成熟，而FaCMB16D-GFP过表达对果实成熟无显著抑制作用（图9c）。同时，FaCMB1-OE、FaCMB16A-OE中FaASR的转录水平显著降低，FaCMB16D-OE不改变FaASR的转录水平（图9g）。表明FaCMB1的磷酸化状态会影响其对FaASR的转录抑制过程。同样发现FaCMB1-OE、FaCMB16A-OE中FaCYP707A4的转录水平显著升高，果实内ABA含量降低，而FaCMB16D-OE果实存在相反表达（图9h）。整体结果表明，FaCMB1的磷酸化缺失会抑制下游FaASR的转录活性，促进FaCYP707A4的转录过程，分解ABA以抑制草莓果实成熟。
图 9 FaCMB1的磷酸化可调控草莓果实成熟
文章小结
该文基于先前“转录组+代谢组”的结果筛选到关键的转录因子FaCMB1，以此为出发点继续深入FaCMB1对草莓果实成熟的调控机制。从转录、磷酸化修饰位点检测、代谢物含量等多个角度阐明FaCMB1的转录级联调控网络，系统性提出：FaSTPK诱导FaCMB1发生磷酸化，降低对FaASR转录抑制过程，进而抑制FaCYP707A4的转录过程，使得ABA得到积累，促进草莓成熟。而FaASR的磷酸化缺陷会逆转该过程，激活对FaASR转录抑制过程，促进FaCYP707A4转录，降低ABA含量。
文章不仅延展了之前的研究基础，更是通过“组学+实验”的充分验证详细阐明转录因子的磷酸化对下游代谢产物的调控过程，层层递进有理有据！
FaCMB1 对草莓果实成熟的调控模型
上海中科新生命自2004年成立以来，一直深耕质谱多组学技术在科研领域的研究应用。自主研发了植物单细胞转录组、植物空间代谢组、修饰蛋白质组、蛋白质组、植物非靶向代谢组、植物高通量靶向代谢组检测平台，近三年累计助力植物领域文章发表500+，累积影响因子1500+，并有多篇合作客户文章在Nature Genetics、Nature Plants、New Phytologist、Journal of Hazardous Material等顶刊发表。
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