肿瘤新生抗原（Neoantigen）是由肿瘤细胞体细胞突变产生的、仅存在于肿瘤组织中的特异性抗原肽，因其不受中枢免疫耐受限制，可被患者自身T细胞高效识别，是个体化肿瘤免疫治疗（新抗原疫苗、TCR-T、过继细胞治疗等）最理想的靶点。然而，新生抗原的筛选面临"预测不准、呈递未知、免疫原性难证"三大瓶颈：基因组预测的假阳性率高，突变能否真实加工呈递到MHC分子上无法仅凭序列推断，候选肽能否激活T细胞更需要功能学验证。

肿瘤新生抗原解决方案是一套覆盖"抗原发现—抗原确认—抗原验证"全流程的闭环技术体系：通过全外显子测序（WES）联合RNA测序（RNAseq）系统性挖掘个体化突变并构建候选新抗原库；通过MHC-肽免疫沉淀串联质谱（IP-MS/MS）直接捕获肿瘤细胞表面真实呈递的天然抗原肽，从实验层面校正预测偏差；最后通过ELISpot功能学实验验证候选肽的免疫原性，输出经三重证据链确认的高置信度新抗原清单，为新抗原疫苗研发、细胞治疗靶点筛选及免疫治疗机制研究提供一站式支撑。

· 技术路线

1. 抗原发现（WES + RNAseq，基因组+转录组联合分析）

对肿瘤组织与匹配正常样本（外周血/癌旁组织）进行全外显子测序（WES），系统识别体细胞突变，覆盖点突变、插入缺失、融合基因等多种变异类型；结合RNAseq验证突变等位基因的转录表达水平，剔除不表达的无效突变，构建个体化新抗原候选数据库。同步进行HLA分型，并采用NetMHCpan等算法预测突变肽与患者HLA分子的结合亲和力，完成候选新抗原的优先级排序。

2. 抗原确认（IP-MS/MS，MHC I-肽免疫沉淀串联质谱）

利用MHC特异性抗体（如W6/32泛MHC I抗体）从肿瘤细胞/组织中免疫沉淀天然MHC-肽复合物，酸洗脱富集呈递肽段，经高分辨率LC-MS/MS直接鉴定肽段序列。该方法是目前唯一能直接证明突变肽被真实加工呈递的实验手段，可将基因组预测清单与实测呈递肽组交叉比对，校正预测偏差、剔除假阳性靶点，并可发现非经典来源（非编码区、可变剪接、翻译后修饰）的新抗原。

3. 抗原验证（ELISpot，免疫原性功能学验证）

从患者外周血单个核细胞（PBMC）中分离T细胞，以候选新抗原肽库进行体外刺激，通过ELISpot检测IFN-γ分泌斑点数，定量评估每条候选肽激活抗原特异性T细胞的能力。该方法灵敏度可达百万分之一（10^-6）低频T细胞检测水平，远高于常规ELISA，已被纳入多项国内外疫苗免疫原性评估指导原则，是新抗原候选肽功能验证的金标准之一。

· 数据分析

· 推荐应用领域

1. 个体化新抗原疫苗研发：为mRNA疫苗、多肽疫苗、DC疫苗提供经质谱呈递证据与功能学验证的高置信度候选肽，已在黑色素瘤、胶质母细胞瘤、胰腺癌、肾癌等多种实体瘤临床试验中证实可诱导持久的肿瘤特异性T细胞应答。

2. 细胞治疗靶点筛选：为TCR-T、TIL等过继细胞治疗筛选经天然呈递确认的突变抗原靶点，降低脱靶风险。

3. 免疫检查点抑制剂疗效与耐药机制研究：解析肿瘤抗原呈递谱与突变负荷，辅助免疫治疗获益人群筛选及抗原呈递通路缺陷相关耐药机制分析。

4. 临床前模型验证：在小鼠同源肿瘤模型（MC38、B16-F10、CT26等）中通过IP-MS/MS直接鉴定真实呈递的突变肽，为新抗原疫苗与联合用药方案提供临床前证据。

· 送样建议

样品类型	说明	推荐送样量
肿瘤组织	新鲜速冻或冻存的肿瘤组织	WES≥30mg, RNA-seq≥50mg, IP-MS≥100mg
癌旁组织	新鲜速冻或冻存的癌旁组织	WES≥30mg, RNA-seq≥50mg, IP-MS≥100mg
细胞样品	悬浮/贴壁培养肿瘤细胞	WES≥5 × 10⁶, RNA-seq≥2 × 10⁶, IP-MS≥1×10^8
外周血（PBMC）	ELISpot功能验证用，新鲜分离或冻存的PBMC	≥1×10^8 活细胞

· 参考文献

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2. Sahin U, Derhovanessian E, Miller M, Kloke BP, Simon P, Löwer M, et al. Personalized RNA mutanome vaccines mobilize poly-specific therapeutic immunity against cancer. Nature. 2017;547(7662):222-226. doi:10.1038/nature23003

3. Keskin DB, Anandappa AJ, Sun J, Tirosh I, Mathewson ND, Li S, et al. Neoantigen vaccine generates intertumoral T cell responses in phase Ib glioblastoma trial. Nature. 2019;565(7738):234-239. doi:10.1038/s41586-018-0792-9

4. Hu Z, Leet DE, Allesøe RL, Oliveira G, Li S, Luoma AM, et al. Personal neoantigen vaccines induce persistent memory T cell responses and epitope spreading in patients with melanoma. Nat Med. 2021;27(3):515-525. doi:10.1038/s41591-020-01206-4

5. Rojas LA, Sethna Z, Soares KC, Olcese C, Pang N, Patterson E, et al. Personalized RNA neoantigen vaccines stimulate T cells in pancreatic cancer. Nature. 2023;618(7963):144-150. doi:10.1038/s41586-023-06063-y

6. Weber JS, Carlino MS, Khattak A, Meniawy T, Ansstas G, Taylor MH, et al. Individualized neoantigen therapy mRNA-4157 (V940) plus pembrolizumab versus pembrolizumab monotherapy in resected melanoma (KEYNOTE-942): a randomized, phase 2b study. Lancet. 2024;403(10427):632-644. doi:10.1016/S0140-6736(23)02268-7

7. Huber F, Arnaud M, Stevenson BJ, et al. A comprehensive proteogenomic pipeline for neoantigen discovery to advance personalized cancer immunotherapy. Nat Biotechnol. 2025;43:1360-1372. doi:10.1038/s41587-024-02420-y

8. Bassani-Sternberg M, Bräunlein E, Klar R, Engleitner T, Sinitcyn P, Audehm S, et al. Direct identification of clinically relevant neoepitopes presented on native human melanoma tissue by mass spectrometry. Nat Commun. 2016;7:13404. doi:10.1038/ncomms13404