干货分享 | UPLC质量肽图分析
2025-07-21
中科新生命
157应用场景
生物药（如单克隆抗体、重组蛋白）的质量控制
确认蛋白质序列正确性
批间一致性分析
实验仪器
1) 高分辨质谱仪：XevoG2-XS QTof (Waters公司)
2) 超高效液相色谱：UPLC (Acquity UPLCⅠ-Class) (Waters公司)
检测流程
样品处理
还原与烷基化：用还原剂（如DTT）打开二硫键，烷基化试剂（如碘乙酰胺）稳定游离巯基。
酶解：使用特异性蛋白酶（如胰蛋白酶）切割蛋白质，生成特征肽段。
色谱分离
UPLC：反相色谱柱（C18）分离肽段，流动相为0.1%甲酸水和0.1%甲酸乙腈梯度。
检测波长：通常为214 nm。
质谱分析
仪器：LC-MS/MS（Q-TOF）
模式：一级质谱（MS1）获取肽段分子量，二级质谱（MS2）获取碎片离子信息。
数据处理
软件：UNIFI
肽图分析原理及流程
结果展示
BPI图谱
BPI色谱图通常显示保留时间在x轴上，以及相对丰度（通常是信号强度）在y轴上。峰的位置和高度可用于识别分子的质量和相对丰度。此图主要反映样品的色谱分离度、肽段信号强度（可以结合上样量判断样品酶解情况）、样品蛋白构成复杂程度等。
肽段通过色谱柱分离后，通常采用紫外（UV）检测器在波长200～230nm范围内检测，最常用的检测波长是214nm。结合质谱检测可对各色谱峰对应的肽段进行定性，确定特征肽段并在肽图谱中进行归属。
UV图谱标注图
肽段信息列表
通过肽段信息列表可以直观的查看检测到的肽段的保留时间、酶切位点信息、及肽段序列、分子量等信息。
常见问题
问
UPLC质量肽图，同一肽段出现不同的洗脱时间？
答
出现不同的洗脱时间，可能由于肽段有异构化现象，分子量一样，但是极性不同，所以会出现洗脱时间有一定的差异。另外有些可能是由于肽段的丰度较高，洗脱时间过长，出现一定的拖尾现象。
问
UPLC质量肽图，蛋白内切酶的自切峰会不会出现在肽谱图上？
答
蛋白内切酶的使用量是蛋白质的1/50，在质谱上基本不会对蛋白质的肽段峰产生影响。
问
UPLC质量肽图的实验重复性如何？能否做到样品和对照的比较？
答
重复性较好，能通过和标准对照品一同实验来比较一致性，主要是判断出峰数量和出峰时间的一致性。最好是样品和对照品一同酶解，一同进行液相检测。如果中间隔较长时间，且不是同一批酶解，可能会出现细小的差别。主要是酶解较难控制。
