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项目文章Nat Metab (IF=18.9) | 华中科技大学和四川大学揭示生酮饮食重塑代谢的新机制

2024-09-26
中科新生命
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赖氨酸β-羟基丁酰化(Kbhb)是由生酮饮食(KD)诱导的翻译后修饰,而许多研究已经证明生酮饮食对多种人类疾病具有治疗作用。很少有人知道Kbhb是如何调节细胞过程的。

2024年8月,华中科技大学薛宇团队和四川大学贾大团队在Nature Metabolism (IF=18.9)发表了题为“Ketogenic diet reshapes cancer metabolism through lysine β-hydroxybutyrylation”的研究论文,该研究通过对小鼠肝脏的多组学分析表明,蛋白质Kbhb受到KD(生酮饮食)的强烈影响。中科新生命为该研究提供了能量代谢靶向检测产品服务。

 

 

 研究材料

对照饮食小鼠(Ctrl):25只

KD小鼠体:26只

肝癌类细胞

肿瘤移植动物模型

 

 

 技术路线

步骤1:转录组学、蛋白质组学、赖氨酸β-羟基丁酰化组学和代谢组学检测分析发现重要通路和重要修饰

步骤2:分层学习框架(pFunK模型)实现了赖氨酸β-羟基丁酰化功能的精准预测

步骤3:pFunK-Kbhb预测潜在具有重要功能的赖氨酸β-羟基丁酰化位点

步骤4:细胞验证pFunK模型统计结果,从而揭示了生酮饮食重塑代谢的新机制

 

 

 研究结果

1. 本研究的主要步骤

KD导致小鼠体重显著下降,显著提高了血液中的酮体 β-羟基丁酸(β-OHB)水平,降低了血糖水平,同时显著增加了Kbhb表达水平(图1a-d)。接下来将小鼠肝脏进行了多组学分析:转录组学、蛋白质组学、赖氨酸β-羟基丁酰化组学和代谢组学(图1e)。为了预测功能上重要的Kbhb位点,通过分层学习框架开发了pFunK模型,量化了Kbhb位点,预测到27种蛋白质中33个潜在的重要Kbhb位点。通过免疫印迹、免疫沉淀、荧光显微镜、伤口愈合试验、集落形成试验和肿瘤异种移植物等实验方法,研究了ALDOB-Kbhb在调节酶活性、mTOR信号通路和肿瘤增殖方面的作用。

图1 本研究的主要步骤

 

2. 小鼠肝脏的多组学分析

通过肽的MS/MS光谱计数,发现3492(62.29%)个β-羟基丁酰化肽(图2a)。通过比较转录组、蛋白质组和赖氨酸β-羟基丁酰组数据,发现差异主要富集在脂质生物合成和转运过程(图2b-d),进一步代谢分析表明Kbhb修饰和能量代谢之间存在潜在的相关性(图2f-g)。通过26种双特异性酪氨酸磷酸化调控激酶检测结果,预测Kbhb修饰可能通过影响酶的催化活性和/或底物结合而发挥作用。

图2小鼠肝脏多组学的联合分析

 

3. Kbhb位点功能相关性的预测(pFunK模型介绍)

作者开发了一个分层学习框架,以预测功能性Kbhb位点(图3a)。pFunK与其他机器学习模型相比,准确性显著提高了(图3b-d)。pFunK还可以明确地区分功能性Kbhb位点和其他Kbhb位点(图3e)。并生成了混淆矩阵来可视化实际结果和预测结果之间的一致性(图3f-g)。pFunK在预测赖氨酸修饰位点、Kbhb位点和功能重要的Kbhb位点方面表现出卓越的性能。

图3 pFunK的层次结构和性能

 

4. pFunK的实验验证

pFunK筛选出27种蛋白质中的33个潜在功能性Kbhb位点,接下来,重点研究排名靠前的六个Kbhb(图4a-b)。在不同酶的Lys修饰位置引入了谷氨酰胺残基,其模拟了β-羟基丁酰化赖氨酸,除p.Lys97Gln突变体的酶活没有变化外,其他突变体的酶活性显著降低(图4c-g)。检查了六个位点的β-羟基丁酰化肽的MS/MS光谱,发现每个β-羟基丁酰化肽中至少可以明确识别出四对b离子和y离子(图4h-k)。因此证明pFunK是预测Kbhb位点的有力工具,可以通过Kbhb改变蛋白质的功能。

图4 pFunK预测Kbhb位点的实验验证

 

5. KD促进ALDOB的Kbhb表达并抑制mTOR信号传导

ALDOB可以催化果糖-1,6-二磷酸(FBP)转化为肝脏中的二羟丙酮磷酸盐和甘油醛3-磷酸(图5a)。KD可提高ALDOB上的Kbhbb表达水平,并且抑制ALDOB酶活性(图5b-c)。在细胞中,β-OHB也可以抑制ALDOB酶活性并增加ALDOB-Kbhb表达水平(图5d)。免疫沉淀也表明Na-β-OHB抑制ALDOB酶活性(图5e)。通过测量mTORC1下游靶点p-S6K和p-4EBP1的磷酸化水平(图5f),表明KD强烈抑制了mTOR通路。且ALDOB K108bhb能降低和FBP的结合,从而降低mTOR信号通路(图5g-i)。

图5 ALDOB Lys108bhb减弱mTOR信号通路

 

6. ALDOB-Lys108的Kbhb抑制癌症细胞增殖

通过肿瘤细胞增殖实验、划痕实验、裸鼠皮下成瘤实验、qPCR实验等证明ALDOB K108bhb抑制癌细胞mTOR信号通路和糖酵解过程,削弱癌细胞增殖(图6)。

图6 ALDOB Lys108bhb抑制HCC和其他类型癌症的细胞增殖

 

7. 重要功能性Kbhb位点的潜在作用

ALDOB-Lys108bhb确实抑制mTOR信号通路,阻碍糖酵解并阻碍癌症增殖(图7a-c)。通过网络构建可以看出,ALDOB在mTOR信号通路、糖酵解和癌症增殖中的功能重要性(图7d)。pFunK模型计算的AUC值>0.9(图7e-f)。重组野生型HADH和突变体的酶活性也是类似的结果(图7g)。

图7 具有潜在功能性Kbhb位点的蛋白质的网络分析

 

 

 总结

在肝癌细胞中消耗KD或补充β-OHB会增加ALDOB Lys108bhb并抑制ALDOB的酶活性。p.Lys108Gln减弱ALDOB活性及其与底物FBP的结合,抑制哺乳动物信号传导和糖酵解的靶点,并显著抑制癌症细胞增殖。该研究揭示了Kbhb在调节癌症细胞代谢中的关键作用,并为预测功能上重要的赖氨酸修饰位点提供了一种普遍适用的算法(pFunK)。

 

 

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