项目文章STTT | 中山大学舒跃龙教授等团队揭示抑制宿主基因GANC表达，能有效阻止流感病毒增殖

小鼠和人的细胞

小鼠和人的细胞全基因组测序、蛋白质免疫印迹、PCR、免疫因子、RNA 测序、蛋白质组学等

为了识别与人类对 H7N9 感染易感性相关的宿主基因，研究团队对感染 H7N9 的217 例个体和116 例健康对照进行了全基因组测序，发现了 MX1 基因的罕见突变与 H7N9 病毒感染易感性相关。在本研究中，研究人员进行了基因的关联分析，并重点关注MAF（次要等位基因频率）＜5% 的低频变异，同时利用不同的预测算法对其潜在危害进行预测。研究发现，GANC 基因与人类对 H7N9 病毒感染的易感性密切相关（图1）。

为了评估 GANC 对体外 H7N9 病毒复制的影响，研究人员构建了 GANC 过表达的 A549 细胞系。蛋白质免疫印迹分析证实，在 A549 细胞中过表达 GANC 后，GANC表达水平至少提高了两倍（图 2a）。与对照组相比， GANC 过表达稳定细胞系的病毒滴度显著升高（图 2b），而细胞活力没有显著影响（图 2c）。随后使用三种不同的siRNA进一步验证 GANC 的作用，这些 siRNA 可使 A549 细胞中 GANC 蛋白表达水平有效降低至少 50%（图 2d）。转染 siRNA 后再感染 H7N9 病毒，研究人员观察到病毒滴度显著降低（图 2e），且细胞活力不受影响（图 2f）。同时还发现，在感染后 24 小时、36 小时和 48 小时，病毒滴度均显著降低（图 2g），且对细胞活力无显著影响（图 2h）。随后构建了杂合 GANC 敲除的 A549 细胞系（称为GANC^+/−）（图 2i），并通过蛋白质免疫印迹进行了验证（图 2j）。与野生型（WT）A549 细胞相比，用 H7N9 病毒感染这些细胞后，病毒滴度显著下降（图 2k），而细胞活力没有显著变化（图 2l）。此外，在GANC^+/−细胞中增加 GANC 表达后，病毒滴度升高（图 2m）。综上所述，这些结果表明，GANC 可能在体外促进 H7N9 病毒的复制。

为进一步探究 GANC 在体内 H7N9 感染过程中的作用，构建了杂合 Ganc 基因敲除小鼠（记为Ganc^+/-）（图 3a）。蛋白质免疫印迹证实，与野生型小鼠（记为Ganc^+/+）相比，Ganc^+/-小鼠肺部的 GANC 蛋白成功敲低（图 3b）。通过对 Ganc 基因进行 PCR 分析，进一步验证了小鼠的基因型（图 3c）。随后，用 H7N9 病毒（3 个小鼠半数致死剂量MLD50经鼻内接种Ganc^+/-和Ganc^+/+小鼠（图 3d）。与体外实验结果一致，Ganc^+/-小鼠在感染后第 4 天和第 7 天，肺部的病毒滴度较低（图 3e）。同时，Ganc^+/-小鼠和Ganc^+/+小鼠的体重没有显著差异（图 3f）。此外，Ganc^+/-小鼠在感染后第 9 天，有 40% 死于感染，而Ganc^+/+小鼠感染后的存活率仅为 20%（图 3g）。第 7 天的肺部成像和病理分析显示，与感染后第 4 天和第 7 天的对照组小鼠相比，Ganc^+/-小鼠的肺损伤较轻（图 3h、i），且与Ganc^+/+小鼠相比，几种炎症因子的丰度降低（图 3j）。这些结果强调了 GANC 在小鼠体内 H7N9病毒复制过程中的关键作用。

为了阐明 GANC 敲低如何通过 PSMD1 和 PSMD2 降解 HA 蛋白，进行了 IP-MS 实验，以筛选与 GANC 相互作用的蛋白。从 HEK293T 细胞中下拉 GANC 蛋白。通过重叠分析，鉴定出 HA 和 GANC 之间的共享蛋白。Co-IP 实验证实了在未感染组和感染 H7N9 病毒后，GANC 与内源性和外源性 PSMD1/PSMD2 之间的相互作用（图 4a）。下拉实验在纯化 GANC 后，进一步验证了它们之间的相互作用（图 4b、c）。Co-IP 实验表明，PSMD1 的 N 端和 C 端区域均与 HA 或 GANC 结合（图 4e、f），PSMD2 的 PCs1 - 5（氨基酸 408 - 594）突变体与 HA 和 GANC 结合（图 4h、i）。随后的竞争性 Co-IP 实验表明，GANC 抑制 HA 与 PSMD1/PSMD2 的相互作用，同时增强自身与 PSMD1/PSMD2 的相互作用，最终导致全细胞裂解物（WCLs）中 HA 蛋白水平增加（图 4j、k）。下拉实验进一步验证了，当 GANC 与 PSMD1/PSMD2 相互作用时，GANC 抑制 HA 与 PSMD1/PSMD2 的相互作用（图 4l、m）。

该研究揭示了中性 α-葡萄糖苷酶 C（GANC）基因在人类 H7N9 感染中的重要作用。通过全基因组测序（WGS）发现GANC 基因的五个低频功能性杂合变异与人类 H7N9 感染密切相关。且观察到在体外和体内 H7N9 病毒感染后，GANC 的 mRNA 和蛋白质表达均有所降低。过表达 GANC，促进H7N9 病毒复制。相反，敲低 GANC 能够在体外和体内抑制包括 H7N9、H9N2 和 H1N1 在内的甲型流感病毒（IAV）复制。这种抑制作用是通过 GANC 促进 H7N9 血凝素（HA）降解来实现的。还发现，敲低 GANC通过促进 HA 与蛋白酶体 26S 亚基非 ATP 酶 1（PSMD1）和 PSMD2 的直接结合来介导抑制作用的。这一新机制揭示了 GANC 如何抑制 HA 降解，从而通过减少 HA 与 PSMD1 和 PSMD2 的结合来促进 H7N9 病毒复制。