Lip-MS项目文章 | 山东大学在Adv Sci发文：揭示草豆蔻活性成分桤木酮改善脂肪肝的靶点及机制

作者首先研究了Alnustone在各种MASLD/MASH模型中改善肝脂肪变性的作用。结果表明，Alnustone给药可有效减轻雄性和雌性小鼠HFD诱导的肝脂肪变性和胰岛素抵抗，改善HFD诱导的MASLD小鼠的肝脂肪变性，减轻MCD或AMLN诱导的MASH小鼠的肝脏脂肪变性、炎症和纤维化（图1）。

接着作者通过细胞实验研究了Alnustone对肝细胞脂肪含量的直接影响，发现Alnustone可预防棕榈酸诱导的小鼠和人肝细胞脂肪变性，保护小鼠和人肝细胞免受脂质积累。进而通过肝脏脂质组分析和能量代谢测定揭示Alnustone促进线粒体脂肪酸β氧化来减少肝脏脂质代谢物（图2）。

为了鉴定Alnustone的分子靶标，作者利用有限蛋白水解-质谱法（LiP-SMap）寻找Alnustone的直接结合蛋白。将棕榈酸诱导的AML12细胞裂解物与Alnustone或空白一起孵育，然后用蛋白酶K，胰蛋白酶和液相色谱-串联质谱法进行有限的蛋白水解。通过这种方法，总共鉴定出12297个肽，注释到2669个显著改变的蛋白质。KEGG富集分析表明，线粒体通路，包括“柠檬酸循环”、“丙酮酸代谢”和“脂肪酸降解”显著富集，这与Alnustone处理后观察到的线粒体功能增强一致。

基于LiP-SMap方法，作者首先筛选了1167种蛋白质，在Alnustone孵育后鉴定出肽段增加和减少。然后作者将这些肽映射到相应的蛋白质上，以筛选在相同或相邻序列中同时上调和下调的肽段，这可以归因于Alnustone的结合，从而逃脱蛋白酶水解。通过这种方法，共有19种蛋白质被确定为潜在的候选蛋白质。对这些候选药物的STRING分析显示，“对脂质的反应”和“线粒体-内质网膜系留”显著富集。如网络所示，CALM1、CALM2和CALM3是核心分子。

接着，作者通过分子对接、表面等离子体共振（SPR）、微尺度热泳（MST）验证了Alnustone与钙调蛋白（CaM）的结合。深入机制挖掘发现Alnustone与钙调蛋白的Ca²⁺结合位点相互作用，导致胞质和线粒体Ca²⁺水平增加，并增强线粒体功能，而肝脏特异性钙调蛋白敲除消除了Alnustone的治疗作用，过表达显著改善了棕榈酸酯诱导的肝细胞脂质积累（图3）。

最后，作者发现在MASLD小鼠模型的肝脏中钙调蛋白的mRNA表达水平显著降低，与血清三酰甘油水平之间负相关。在临床MASLD和MASH患者的人肝脏中钙调蛋白的mRNA表达水平下调，蛋白丰度降低，与NAFLD活动评分（NAS）呈负相关。为了确定钙调蛋白在人类MASLD中的遗传因果作用，作者进行了基于汇总数据的孟德尔随机化（SMR）分析，以评估与CALM基因表达水平相关的遗传变异与MASLD风险之间的因果关系，确定CALM基因在遗传上与MASLD风险降低相关（图4）。

作者结合来自多个MASLD小鼠模型、肝细胞系统和人类MASLD发现的数据，发现Alnustone通过增强线粒体脂肪酸β氧化，可以作为治疗MASLD/MASH的有效天然化合物。此外，作者确定钙调蛋白 / Ca²⁺信号通路是Alnustone增强线粒体脂肪酸β氧化的关键机制（图5）。研究结果表明钙调蛋白是一个有前途的靶点，Alnustone是一种很有前途的天然治疗剂，通过靶向钙调蛋白来治疗MASLD/MASH。