项目文章J Hepatol | 肠肝轴再发IF30+顶刊！广医二院联合暨大发现可改善肝癌TACE术后肝损伤的肠道益生菌及代谢物

大鼠（正常、HCC、无菌、ABX处理）、人

宏基因组/16S多样性分析、非靶代谢组、转录组、蛋白组、ELISA等

HE染色证实TACE后大鼠出现以凝固性坏死为主要特征的明显肝损伤。对未经TACE治疗的ABX预处理大鼠的粪便FMT对其肝功能没有影响。与接受TACE前配对粪便的大鼠相比，接受TACE后供体FMT的大鼠表现出更严重的TACE-LI。在TACE治疗后，DEN诱导的HCC大鼠中也观察到肝损伤，而ABX消耗肠道微生物群进一步加剧了TACE-LI，ABX预处理的HCC大鼠接受来自TACE后供者的粪便微生物群，比接受来自TACE前供者的配对粪便的大鼠表现出更严重的TACE-LI此外，与接受配对的TACE前粪便相比，接受TACE后粪便微生物群的无菌（GF）大鼠始终表现出更严重的TACE-LI。这些数据表明，TACE后肠道微生物群稳态被破坏，加重了TACE- LI。

通过使用不同类型的抗生素，最终确定革兰氏阳性菌而非革兰氏阴性菌可能在预防TACE-LI中起关键作用。根据16S rRNA和宏基因组测序，在肝癌大鼠和患者粪便中常见的细菌变化中，革兰氏阳性罗伊氏乳杆菌（L. reuteri）丰度下降最为显著，qPCR结果证实肝癌大鼠和患者粪便中罗伊氏乳杆菌在TACE后均显著减少。进一步发现活的罗伊氏乳杆菌比死的罗伊氏乳杆菌对TACE-LI具有保护作用。一致地，在ABX预处理和GF大鼠中，活的罗伊氏乳杆菌也显著抑制TACE-LI。此外，从健康大鼠和HCC患者粪便中分离的罗伊氏乳杆菌菌株均能显著抑制正常大鼠和HCC大鼠的TACE-LI。这些结果表明，活的罗伊氏乳杆菌对TACE-LI具有重要的保护作用。

非靶代谢组结果表明，罗伊氏乳杆菌可以分泌与多种代谢途径相关的多种化合物，而HCC大鼠的肠道微生物群在TACE后也显示出明显的代谢谱改变，只有三种微生物代谢物（吲哚-3-乳酸[ILA]、莽草酸和大豆苷元）的水平同时在罗伊氏乳杆菌培养上清中显著增加，而在TACE后HCC大鼠的粪便中显著减少。且只有ILA同时在罗伊氏乳杆菌培养上清和TACE后HCC大鼠的粪便中显示出显著差异。LC-MS/MS结果证实活的罗伊氏乳杆菌可以产生丰富的ILA， HCC大鼠和患者中TACE后的ILA水平均随着罗伊氏乳杆菌水平的降低而显著降低。罗伊氏乳杆菌的苯乳酸脱氢酶（fldH）是唯一作用于芳香氨基酸转氨酶产生的吲哚-3-丙酮酸形成ILA的关键酶。构建fldh敲除（KO）罗伊氏乳杆菌（L. reuteri^ΔfldH）显示KO和WT细菌在体外的生长没有差异，L. reuteri^ΔfldH的ILA水平在体外和体内均明显低于WT，且对TACE-LI的保护能力显著降低。

通过转录组发现TACE组中许多炎症相关通路和炎症相关因子的差异显著增强，在TACE处理的大鼠中，无论是ILA还是罗伊氏乳杆菌都能显著抑制CD68⁺肝巨噬细胞的积累及其以TNF-α、IL-1β、IL-6、Ccl2和Cxcl2为代表的促炎反应，而在L. reuteri^ΔfldH处理的大鼠中，这种抗炎反应几乎被消除。在TACE治疗前用氯钠脂质体（LIPO）消耗巨噬细胞，巨噬细胞耗竭能有效减轻大鼠肝脏的促炎反应和TACE-LI，而ILA和罗伊氏乳杆菌均不能进一步改善脂质预处理大鼠的TACE-LI，另外构建模拟TACE的骨髓源性巨噬细胞（BMDM）和人单核细胞源性巨噬细胞（THP-1-dM）模型，发现ILA可以抑制模拟TACE的巨噬细胞的促炎反应。

通过药物亲和响应目标稳定（dart）实验、LC MS/MS凝胶分析、分子对接和评分策略来确定ILA的潜在分子靶点。ILA处理后发现热休克蛋白90 （HSP90; 90kDa）与降解降低显著相关，且ILA增强了HSP90蛋白的抗蛋白酶水解。细胞热移实验也证实ILA处理显著增强了HSP90的热稳定性，降低了其降解率。此外，表面等离子体共振（SPR）分析显示，ILA与HSP90（HSP90抑制剂STA-9090作为对照）之间存在剂量依赖的直接相互作用。分子对接和SPR分析表明ILA可以作为HSP90的内源性抑制剂，直接与HSP90 ATP袋结合，使HSP90 ATP酶失活，从而发挥治疗作用。以及ILA通过与HSP90结合，显著抑制HSP90-NLRP3复合物的形成，抑制NLRP3和裂解caspase1的表达（p20），降低了TACE模拟巨噬细胞中ASC的低聚化。此外，STA-9090（特异性HSP90抑制剂）显著抑制NLRP3炎性体的启动，降低TACE模拟巨噬细胞的促炎反应。ILA治疗对降低STA-9090处理的巨噬细胞的促炎反应没有额外的作用。

通过动物实验同样验证罗伊氏乳杆菌和ILA通过影响HSP90 NLRP3相互作用来保护大鼠抗TACE-LI。利用递送HSP90-siRNA （siHSP90）的靶向纳米系统建立肝巨噬细胞特异性沉默hsp90的大鼠模型，结果表明Ab-NP@siHSP90可以有效地在大鼠肝巨噬细胞中实现siRNA的特异性传递和HSP90的抑制，以及罗伊氏乳杆菌衍生的ILA对TACE-LI的保护作用至少部分依赖于抑制HSP90-NLRP3相互作用。

根据肝功能恢复情况将病人分为术后正常恢复组（NR组）和延迟恢复组（DR组），其中NR组TACE前罗伊氏乳杆菌丰度和ILA水平明显高于DR组。在TACE后3天内，较严重的LI患者（2-4级）的ILA水平和罗伊氏乳杆菌丰度明显低于肝功能较好的患者（1级）。在TACE后25-35天，尽管相当一部分患者的ALT、AST、ALP和TBIL水平和凝血酶原时间恢复到相当接近基线水平，但ILA水平和罗伊氏乳杆菌丰度降低的患者往往更容易受到TACE-LI的影响。使用白蛋白胆红素（ALBI）评分评估LI，发现与基线相比，TACE治疗的HCC患者肝功能明显受损）。低水平的ILA和罗伊氏乳杆菌丰度始终与肝功能受损相关。以及ROC分析确定将经TACE治疗的HCC患者分为罗伊氏乳杆菌高组和罗伊氏乳杆菌低组，以及ILA高组和ILA低组。