iMeta(IF33.2) | 瘤内微生物研究怎么做？上海交大刘宁宁/王慧等多组学研究揭示结直肠癌进程中组织微生物-蛋白互作关系

腺瘤组织、肿瘤旁组织、肿瘤组织

宏基因组、蛋白组

1. 通过荧光原位杂交和PCR确认组织中存在菌群；

2. 宏基因组检测物种变化、多样性变化、并对物种菌群做分群处理；

3. 蛋白组检测蛋白种类变化、通路变化、分型变化，蛋白互作网络变化；

4. 分析腺瘤组织(A)、肿瘤旁组织(P)、肿瘤组织(T)之间，以及CRC进程中微生物-蛋白互作关系；

5. 构建微生物蛋白标志物，并在体外验证。

使用FISH、PCR确认组织中存在菌群，且与腺瘤组织(A)和肿瘤旁组织(P)相比，配对肿瘤组织(T)的真菌群落富集量显著增加。宏基因组分析发现与A组相比，T组α多样性显著降低，但早期和晚期肿瘤组织之间没有观察到显著差异，以及Bray-Curtis计算显示A，P和T样品群落多样性显著差异。

在属和种水平上，T和P组织中的细菌和真菌谱更紧密地排列在一起，而古细菌组成在A、P和T样品中保持相对一致。在A样品中，观察到Saccharomycodes显著减少，伴随着Bacteroides和Fusobacterium种类的显著增加。与P组织相比，T组织样品中F. nucleatum的丰度更高，而A组织样品中F. nucleatum, B. fragilis, P. micra 和 Porphyromonas asaccharolytica的丰度显著降低。

以DMM模型进行群落分型，共计四个不同的微生物群M1-M4，M4的多样性最低，含有更高丰度的口腔分类群，66.13%的腺瘤微生物被分类为M1，A样本的比例从M1到M4逐渐减少，M4主要由T和P样品组成。

在种水平上，在早期和晚期肿瘤组织中，负相关变得更加突出，这种模式可能是由TME内致病菌的富集所驱动。对P和T组织中的微生物种类和途径进行了Spearman相关分析，转座酶IS116/IS110/IS902家族、肽酶M16和主要促进剂超家族在P组中分别与12.5%、30%和15.63%的微生物负相关，而在T组中这一比例分别为9.38%、9.38%和12.5%。

蛋白组分析显示，与P相比，T的癌症相关途径显著改变，肿瘤组织显示增殖相关通路以及致癌信号包括Wnt/β-catenin和NF-κB的富集。相反，与A相比，p53信号通路在T中显著下调。对P和T之间的2,847个DEPs进行了分层聚类，鉴定出四个不同的蛋白质组学簇，C1的特征是代谢和RNA转运途径的富集。C2的特征是参与紧密连接、基础转录因子和PPAR信号传导的蛋白上调。C3以紧密连接和Wnt信号通路下调为标志，而C4则以代谢和Hippo通路活性降低为标志。C3与微卫星不稳定性（CMS1/CPTAC-B）相关，提示免疫治疗的潜在适用性。相反，C4（与CMS4/CPTAC-C相关，通常与预后不良相关）在结肠癌中更常见，而直肠癌更常被分类为C2、C3或C4。

为了从功能上验证微生物群驱动的途径激活，将产肠毒素的Bacteroides fragilis（ETBF）与患者来源的结直肠癌类器官共培养。ETBF感染（MOI = 50）显著增加了增殖标志物Ki67和磷酸化β-catenin的表达。

利用IPA分析发现，与P组织相比，T样品中癌症和胃肠道疾病通路显著富集，T组中LXR/RXR激活途径的显著抑制，衰老通路、IL-6信号通路和14-3-3介导的信号通路被显著激活。蛋白质相互作用和调控途径的复杂网络，强调了TME内分子串扰的复杂性，并突出了宿主蛋白作为CRC的潜在治疗靶点。

运用LASSO回归分析显示，A中宿主蛋白与140种微生物之间存在1382种关联，P中存在2696种关联，T中存在1045种关联。基于稀疏典型相关分析和LASSO回归分析确定不同组之间的“共享”和“特定”路径，最常见的共享途径包括核质、细胞外泌体和RNA结合途径。以及互作方面在A中，机会真菌病原体念珠菌与多种宿主蛋白相关。

宿主-微生物组在早期肿瘤组织中的相互作用（628个关联）比在晚期肿瘤组织中的相互作用（484个关联）表现出更大的复杂性。对腺瘤、早期和晚期肿瘤组织中前五种共有和特定途径进行分析，发现了三种共同的途径：核质、代谢和RNA结合。以及在某些途径中，发现白色念珠菌在晚期肿瘤中与多种宿主蛋白相互作用。

基于神经网络的微生物代谢物载体分析发现三种不同的真菌驱动簇，称为“真菌型”（F1-F3），naïve B细胞在T和P中与F2共同发生的频率低于A，而浆细胞在癌症进展过程中与分枝型的关联增加。霉菌型，特别是F3，与一系列细菌分类群，如梭杆菌、普雷沃氏菌和拟杆菌有很强的共现性，以及对数比比较在A和T之间有所不同，表明真菌相关微生态组成受到干扰。这些结果表明，组织特异性真菌型建立在多领域微生物和宿主免疫相互作用的基础上，强调了结肠直肠癌发生过程中的生态重组。

利用随机森林算法的监督机器学习的基尼重要性排序，确定了8种细菌、3种真菌、2种古细菌和1种病毒作为区分A和T的候选生物标志物，以及6种细菌和2种真菌作为区分早期和晚期肿瘤组织的候选生物标志物。通过五倍交叉验证，所得分类器在接收者工作特征曲线（AUROC）下的面积为0.957（A vs. T）和0.792（早期vs.晚期）。另外收集了公开可用的转录组数据来测试蛋白质生物标志物在CRC筛查中的表现。与本研究结果一致，标记在A/T分类器的两个外部验证队列中的AUROC分别为0.920和0.735，而早期/晚期分类器的AUROC范围为0.693至0.744。

由于F. nucleatum在T中表现出高丰度，并且具有阶段依赖的相关模式，表明在CRC进展中起积极作用。将小鼠MC38细胞皮下植入C57BL/6小鼠，建立了CRC同种异体移植小鼠模型，与PBS对照组相比，F. nucleatum处理的小鼠肿瘤大小增大，Western blot分析证实，在核核F.感染小鼠的肿瘤中，β-catenin和NF-κB p65表达上调，直接将核核F.与这些致癌信号通路的激活联系起来。这些体内结果与蛋白质组学数据一致，并强化了核梭菌作为CRC进展的微生物调节剂的作用。

文章使用宏基因组学和蛋白质组学对185个组织样本进行了综合分析，包括腺瘤(A)，配对肿瘤(T)和肿瘤旁(P)。发现了明显的肿瘤内微生物群失调，表明存在CRC特异性的多界微生物生态系统。蛋白质组学分析揭示了四种CRC亚型（C1-C4），每种亚型都具有独特的临床预后和分子特征。并进一步利用相互作用，鉴定了14个多领域微生物和8个蛋白质标记，它们与T样品有很强的区别（受试者工作特征曲线下面积(AUROC) = 0.962），并在两个独立的数据集中进行了外部验证（AUROC = 0.920和0.735）。此外，使用8个微生物和4个蛋白质标记构建了早期与晚期的分类器，该分类器具有较高的诊断准确率（AUROC = 0.926），并进行了外部验证（AUROC = 0.659-0.744）。在患者来源的类器官和小鼠同种异体移植模型中进行的功能验证证实，证实了这些生物标志物的功能潜力。