项目文章｜Adv Sci 封面力作！南方医科大学团队阐明肌腱蛋白C介导肾损伤后促炎-促纤维化的核心机制！

sham组和单肾缺血再灌注（UIRI）组的小鼠分别进行scRNA-seq和ST分析，发现纤维化肾脏中受损的肾小管上皮细胞、免疫细胞和成纤维细胞显著增加，并有显著的空间重组现象，sham组保留皮质-肾髓质分区，包括皮质、外髓质的外侧条带（OOM/CMJ）、外髓质的内侧条带（IOM）和内髓质（IM）。UIRI组在皮质中富集与损伤相关的肾小管，PTS3肾小管段被免疫细胞和成纤维细胞代替，形成两个不同的纤维化微环境：Niche1 富集成纤维细胞、免疫细胞和残留的肾小管细胞，而 Niche2 具有特化的成纤维细胞-巨噬细胞/单核细胞共定位特征，这种独特的空间结构可能是驱动纤维化的关键微环境。

Visium和Visium HD空转数据一致显示空间上存在差异的基因模块：Factor 3与纤维细胞相关；Factor 11与巨噬细胞相关。单细胞谱系追踪证实，Tnc 主要由纤维细胞分泌，其空间表达仅限于CMJ 成纤维细胞-巨噬细胞簇中，与 Tnc 共表达的前 10 种分子均来自巨噬细胞。免疫荧光证实TNC蛋白主要在 CMJ区域且与巨噬细胞共定位。综上，成纤维细胞通过有限空间范围内分泌 TNC 构建纤维化微环境。

单侧输尿管梗阻（UUO）模型的单细胞和空间转录组数据显示，虽然UUO引发的纤维化主要集中在IOM-IM结合处，同样表现出成纤维细胞与巨噬细胞的共表达及保守的TNC 空间模式，与前文结果一致。

空间配体-受体分析在 CMJ 中发现了一个重要的成纤维细胞-巨噬细胞通讯枢纽，结合单细胞互作结果——成纤维细胞产生的 TNC 通过FBG与巨噬细胞的 TLR4 结合，为成纤维细胞生成微环境内的基质-免疫互作提供见解。接下来，通过体内外实验，明确富含 TNC 的微环境能够促进巨噬细胞的活化。

BMDMs与TNC蛋白混合培养的RNA-seq结果，揭示对照组和TNC刺激组巨噬细胞的基因表达存在显著差异，GO分析富集大量与免疫反应、细胞因子受体结合及免疫受体活性相关的基因；KEGG富集多个与炎症相关的信号通路，包括细胞因子受体相互作用、TNF、TLR 和 NF-𝜅B 信号通路。TLR 信号通路在 TNC 刺激的巨噬细胞中更为活跃，其在体外促进巨噬细胞的增殖、活化、迁移、吞噬和产生细胞因子。

通过共免疫沉淀（Co-IP）和体外实验证实TNC 以剂量依赖的方式上调TLR4、p-P65、TNF-α 和 CCL2 的表达，表明 TNC 激活了 TLR4/NF-κB 信号通路，并通过刺激 TLR4/NF-κB 信号级联来激活巨噬细胞。

在体内 UIRI 情况下，TNC 缺失抑制 UIRI 后肾脏中IL-6、 IL-1𝛽 、TLR4、p-P65 和 P65 等的表达，与对照组相比，UIRI小鼠肾中央髓质区域的 F4/80⁺和TLR4⁺细胞数量增加，且二者共定位，在敲低 TNC 后，F4/80⁺/TLR4⁺巨噬细胞数量显著减少。与sham组相比，UIRI 小鼠肾脏中检测到更多的 F4/80⁺/CD11b⁺巨噬细胞，而在 TNC 缺失后减少。此外，敲低TNC减轻UIRI 肾脏 CMJ 区域肾纤维化病变，表明内源性 TNC 促进巨噬细胞活化和肾纤维化。

UIRI组使用TAK-242（TLR4抑制剂），抑制MR、Arg-1、TNF-α 和 CCL2、 TLR4 的表达，降低TNC、纤维连接蛋白和 α-SMA，减少CMJ 区域巨噬细胞浸润，表明TNC 介导的 TLR4 激活会在体内促进肾脏的炎症和纤维化过程。作者通过TLR4 KO小鼠的蛋白印记、RNA-seq及体外实验证实TNC 介导的 TLR4 激活对于损伤后的肾脏炎症和纤维化是必需的，且TNC 介导的巨噬细胞活化依赖于 TLR4 信号通路。

与移植野生型骨髓的野生型小鼠（WT-WT）组相比，移植 TLR4 基因敲除骨髓的野生型受体小鼠（WT-TLR4 KO）组中，肾脏炎症和纤维化程度显著减轻，抑制TLR4/NF-κB 活化和TNF-α、CCL2 、TNC、FN 和α-SMA 的表达，减少巨噬细胞浸润。综上，巨噬细胞中TNC触发的TLR4激活是驱动损伤后肾脏炎症与纤维化的关键机制。