项目文章STTT（IF52.7）| 复旦大学樊嘉院士/柯爱武/高超团队研究解锁介导肝细胞癌仑伐替尼耐药关键因子——NGF!

1. 筛选与耐药相关的分泌因子

构建具有稳定表型的仑伐替尼耐药肝癌细胞系（LenR-细胞），对G0和G4细胞上清液进行蛋白质组学分析，在六种候选蛋白中验证发现神经生长因子NGF可以抑制细胞凋亡进而可增强肝癌细胞对仑伐替尼的耐药性。

2. 通过基因消融技术破坏NGF可恢复仑伐替尼的敏感性

构建NGF-KO的G4细胞，和NGF-OE的G0细胞，发现NGF缺失或外源性α-NGF显著抑制G4的增殖，并降低其仑伐替尼的IC₅₀值；NGF过表达无论是否接受仑伐替尼治疗都加速了肿瘤生长。IHC分析显示，NGF过度表达可促进肿瘤增殖和血管生成，而NGF基因敲除则增强了仑伐替尼对肿瘤的抑制作用。在人群样本中，队列1中术后辅助仑伐替尼治疗的患者复发肿瘤中的NGF表达明显高于其对应的原发病变；队列2中术前仑伐替尼治疗的患者（RT组）相比于经任何术前治疗的患者（NT）中NGF显著上调，以及NGF表达水平高的患者SD比例更高，而低NGF表达水平的患者PR比例更高。scRNA-seq显示，与NGF相关的转录特征和与血管生成相关的基因在来自复发性肿瘤的细胞中主要富集。

3. NGF/TrkA信号通路的激活会增强仑伐替尼的耐药性

分析HPA数据库，在HCC组织中TrkA的表达显著高于NGFR，并在队列1中高表达NGF的配对样品中得到验证。对G0和G4细胞磷酸化蛋白质组学进行分析显示MAPK和神经营养因子信号通路在G4中显著富集，MEK5-ERK5信号显示出随着耐药性发展的逐渐增加，并且MEK5/ERK5基因敲除显著增强了仑伐替尼在耐药细胞中的治疗效果。而在接受仑伐替尼处理后，耐药细胞表现出明显的从ERK1/2占主导的信号通路向ERK5占主导的信号通路的转变。以及，用中和抗体或TrkA抑制剂对NGF/TrkA进行功能阻断，会优先抑制MEK5-ERK5的活性，而增强ERK1/2的活性受到抑制。MEK5（BIX02189）、ERK5（XMD8-92）和TrkA（larotrectinib）抑制剂在G4细胞中与仑伐替尼表现出显著的协同作用，在早期耐药阶段（G1-G2），ERK1/2抑制（SCH772984）与仑伐替尼的联合使用效果显著增强，但在更严重的耐药阶段（G3-G4）其效果则有所减弱。相反，ERK5抑制在耐药进展过程中显示出更强的协同作用。

另外，在早期耐药阶段（G1）中，EGF的分泌和EGFR的磷酸化均达到峰值，但在后续代次（G2至G4）中则逐渐下降，EGFR抑制剂厄洛替尼在G1期与仑伐替尼协同作用，但在G4期则没有这种协同作用。

4. 选择性剪接增强了神经生长因子（NGF）的表达潜力

检测发现从G0到G4，NGF的mRNA水平保持相对稳定，且RIP测序证实NGF的mRNA与剪接因子SRSF1在G4细胞中存在特定的相互作用，这种结合在G4细胞中较为显著。通过qPCR发现NGF的两种可变剪接转录本在G0期proNGF-A的表达占主导地位，而在G4期proNGF-B占主导地位，在G4期敲低SRSF1显著增加了proNGF-A的水平，并降低了proNGF-B的水平。体外转录实验证实，在LenR-G4和HEK293T细胞中，proNGF-B产生的NGF蛋白量明显多于proNGF-A。并进一步通过RBPmap、CLIP、Sanger测序确定了关键的相互作用位点。

5. SRPK1/SRSF1轴调控proNGF-B的选择性剪接

对G0和G4组进行转录组测序，在G4细胞中，NGF基因特异性地经历了MXE剪接，且SRPK1在G4组中显著上调。分别在G0和G4背景下建立了稳定表达SRPK1和敲除SRPK1的细胞系，发现SRPK1的缺失显著降低了包括SRSF1在内的几种SRSF蛋白的磷酸化水平，而SRPK1的过表达则产生了相反的效果；SRPK1的过表达增强了PC12细胞中的NGF生成并促进了神经突的生长，而敲除SRPK1或使用SPHINX31进行药理学抑制则显著降低了NGF的表达。在表型上，G0细胞中SRPK1的过表达显著增加了仑伐替尼的IC₅₀值，而G4细胞中敲除SRPK1则恢复了对药物的敏感性。在SRPK1过表达的G0细胞中敲低SRSF1显著降低了proNGF-B转录水平和NGF蛋白表达。在仑伐替尼治疗下，SRPK1过表达优先激活TrkA-MEK1/2-ERK1/2轴，而SRPK1基因敲除则抑制了耐药细胞中的TrkA-MEK5-ERK5通路，且SRSF1过表达无法在缺乏SRPK1的情况下挽救神经生长因子的表达，而SRSF1的敲除则显著减弱了由SRPK1驱动的仑伐替尼耐药性。

6. 针对 NGF/TrkA 轴可减轻仑伐替尼耐药性肝癌

在免疫功能正常的C57BL/6小鼠中过表达Myc并敲除Trp53（Myc^OETrp53^KO），并通过腺病毒递送实现了肝脏特异性表达SRPK1。免疫组化结果显示，SRPK1过表达显著加速了肝脏肿瘤进展，仑伐替尼单药治疗效果有限，而拉罗替尼则产生了适度的抗肿瘤效果。然而，联合治疗产生了最显著的肿瘤抑制作用，在肝组织匀浆中检测到的NGF水平，在SRPK1过表达组中显著高于对照组。

在人群组织样本中，耐药（RT）的肿瘤与非耐药（NT）肿瘤相比，其SRPK1表达显著更高，RT组中的SRPK1和NGF均呈上调状态，临床表现上高SRPK1表达组的SD更为常见，而低SRPK1表达患者的PR更为普遍。scRNA-seq发现，与对仑伐替尼敏感的细胞相比，耐药细胞表现出更强的神经生长因子信号通路、非经典MAPK/ERK5通路以及MAPK-Trk轴的激活，映射到tSNE图上，发现敏感细胞主要依赖于经典的MAPK信号通路（ERK1/2），而耐药细胞则通过ERK5转向非经典MAPK信号通路。使用低NGF表达的原发肿瘤（敏感）和仑伐替尼治疗后高NGF表达的残留肿瘤（耐药）建立了患者来源的异种移植（PDX）和组织小体（PDO），PDX之间的治疗反应差异显著：在NGF低表达的肿瘤中，仑伐替尼单药治疗显著抑制肿瘤生长。然而，在NGF高表达的耐药肿瘤中，仑伐替尼单药治疗基本无效，而拉罗替尼则表现出更优的抗肿瘤活性。这种联合治疗产生了协同效应，在原位肿瘤模型（PDX）和原位疾病模型（PDO）中实现了对肿瘤的最大抑制作用，且没有出现严重的毒性反应。

该研究发现源自肝癌细胞NGF是仑伐替尼耐药性的关键介质。通过建立表型稳定的LenR细胞，对培养基进行蛋白质组学筛选，并随后进行功能验证，证明NGF的分泌随着耐药性的获得而逐渐增加。机制上，SRPK1-SRSF1轴通过调节其前体转录物的可变剪接来驱动NGF的产生，升高的NGF通过其高亲和力受体TrkA激活非经典MAPK通路（MEK5-ERK5），从而在持续的酪氨酸激酶抑制剂压力下维持肿瘤细胞的存活和增殖。通过将TrkA的药物靶向治疗与抑制剂larotrectinib相结合，能够恢复lenvatinib在患者来源的组织培养物和异种移植模型中的敏感性，从而产生显著的协同抗肿瘤效果，且未出现毒性加剧的迹象。

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