Cell | 继 Nature 后再添顶刊！林鸿宣院士团队破译水稻耐热三级调控机制，推动从实验室机制解析到田间按需育种应用的转化

（1）野生型株系：水稻热敏品种（华粳籼，HJX）、耐热品种（TT2功能缺失，NIL-TT2^HPS32）、ZH11；

（2）转基因过表达株系：DGK7过表达株系（DGK7^OE/HJX）、MdPDE1过表达株系（MdPDE1^OE/ZH11）、MdPDE1过表达株系（MdPDE1^OE/ NIL-TT2^HPS32）、RGb1过表达株系（RGB1^OE/HJX）、DGK7过表达TT2功能缺失株系（DGK7^OE/NIL-TT2^HPS32）、DGK7过表达TT2过表达株系（TT2^OE/DGK7^OE/NIL-TT2^HPS32）

为筛选参与热信号传递的关键调控因子，作者基于先前的热胁迫转录组数据，按照：

（1）快速响应热应激并在热暴露期间持续高表达；

（2）一旦热信号被移除就下调表达；

的规则共筛选到479个差异表达基因（说明这些基因受温度调控）。随后，使用水稻热敏品种（华粳籼，HJX）和耐热品种（NIL-TT2^HPS32）进行转录组分析。在NIL-TT2^HPS32中下调表达的基因主要参与“脂质相关”途径。韦恩分析表明，有4个基因同时存在于脂质途径和上述479个基因中，暗示其参与热诱导脂质重塑。并且这4个基因中Os01G0783200可编码DGK7，将甘油二酯（DAG）磷酸化为PA32。广靶脂质组提示DAG（DAG36:3和DAG36:2）在组间显著差异表达。整体结果表明：DGK7以DAG为底物，将TT2调控的G蛋白信号与热应激下的脂质调节联系起来。

由于TT2必须与水稻Gβ亚基（RGb1）形成二聚体传递信号，作者在HJX背景下获得过表达RGb1的转基因植物（RGB1^OE/HJX）。发现，与野生型HJX相比，RGB1^OE/HJX植株的耐热性和存活率降低，该结果在拟南芥中得到证实。表明，RGB1可负调节水稻耐热性。转录组GSEA结果表明：G蛋白偶联受体信号通路与热应激处理正相关，且DGK7位于此通路中，表明DGK7可能是一个重要的热信号解码因子，可连接G蛋白信号与脂质代谢。

过表达DGK7，可增加水稻幼苗的耐热性和存活率。抑制DGK7表达，水稻耐热性也随之降低。说明DGK7可正向调控水稻耐热性，而同时过表达TT2时（TT2^OE/DGK7^OE/NIL-TT2^HPS32），DGK7的正调控过程消失，说明TT2可抑制DGK7的功能且DGK7作为TT2的下游发挥作用。

瞬时表达实验表明DGK7与TT2同时在质膜中表达且DGK7的定位不依赖于TT2是否存在。热胁迫也不会改变DGK7与TT2在质膜中的表达位置。双分子荧光互补（BiFC）、分离荧光素酶互补（SFLC）、免疫共沉淀（coIP）表明DGK7在质膜上与TT2和RGB1存在特异性物理互作，且该过程不受热胁迫影响。

有研究报道DGKs磷酸化可将DAG转化为PA。对表达的重组蛋白DGK7进行纯化，并通过其对三磷酸腺苷的消耗来量化DGK活性。发现，当DAG存在时，DGK活性显著增强。过表达DGK7株系可显著降低总DAG水平并增加PA积累，当DGK7与TT2双过表达时（TT2^OE/DGK7^OE/NIL-TT2^HPS32），总DAG和PA表达水平与对照组NIL-TT2^HPS32无显著差异。整体结果表明：DGK7在体内和体外都具有DGK活性，并有助于PA的积累，而TT2可对其进行负调控。

对NC组、热敏感组（HJX）和热耐受组（NIL-TT2^HPS32）进行广靶脂质组检测，揭示TT2在热刺激下对DAG和PA代谢的影响。发现，与NC相比，NIL-TT2^HPS32的PA总量增加大于HJX，而DAG积累量小于HJX，表明热胁迫下TT2可通过抑制DGK7活性，增加DAG积累和降低PA活性。结合转录组、脂质组、修饰蛋白鉴定进一步揭示机制：热胁迫下，TT2可通过去磷酸化抑制DGK7中Ser⁴⁷⁷位点的磷酸化过程，降低DGK7活性，降低DGK7对DAG转化至PA的过程，使积累DAG，PA表达水平降低。

如何深入了解DGK7介导的脂质变化如何将物理热信号解码为生物细胞内生物学响应？

序列比对发现DGK成员中有6个含有腺酰环化酶（AC）基序的关键残基，提示DGK7在cAMP产生中发挥作用。体外DGK7酶活性测定发现，DGK7无法水解cAMP为腺苷-磷酸（AMP）。结合RNA-seq分析正常条件和20h热胁迫下，DGK7过表达株系中，热响应基因的表达模式与cAMP下调基因高度重叠，表明DGK7的转录调控效应与cAMP信号相反。整体结果表明，DGK7本身不具有环化酶和磷酸二酯酶活性，无法直接催化cAMP，但可通过间接机制负向调控cAMP水平。

由于DGK7本身不具备环化酶（PDE）活性，无法直接降解cAMP。作者假设应该存在一个中间分子，该分子具有PDE活性并具有感知DGK7产生的PA信号，可以与PA结合，从而实现DGK7对cAMP的间接负调控。

通过分析PDE与PA的结合基序，作者将目光聚焦到一个金属依赖的磷酸二酯酶（MdPDE1）。通过体外酶活验证、体内功能验证表明，MdPDE1可感知DGK7产生的PA信号，与PA结合降解cAMP，从而将脂质信号转化为cAMP信号，最终赋予水稻耐热性。

研究表明，高温胁迫下富集于质膜的磷酸酯（PA）可通过DGK活性转位至细胞核中。因此，MdPDE1与PA的结合是否促进MdPDE1定位在细胞核内，从而调节热响应的下游cAMP信号？

通过本氏烟草叶片瞬时表达，发现正常温度下，MdPDE1主要定位于细胞质。当热胁迫处理15min后，MdPDE1迅速在细胞核内积累，并持续至少1h。破坏MdPDE1与PA结合会完全阻断其核转位过程，表明MdPDE1与PA结合是MdPDE1转移到细胞核的前提。DGK7通过催化DAG生成PA，为MdPDE1提供核转位信号，当DGK7磷酸化后，可显著促进MdPDE1核转位，而去磷酸化后，促进效果消失，表明DGK7激酶活性是调控MdPDE1核转位的关键。当DGK7激酶活性被TT2抑制时，会减少PA生成，进而降低PA与MdPDE1的结合，减弱核转位过程。因此，整体结果表明：热胁迫下，TT2低表达可增强DGK7的激酶活性，促进DGK7将DAG转化为PA，进而增加PA与MdPDE1的结合，促进MdPDE1入核并在核内降低cAMP表达，以实现植物耐热。

上文已证实MdPDE1降解cAMP赋予水稻耐热性，但cAMP如何转化为生理响应尚不清楚。基于ROS是热胁迫的主要影响过程。作者提出假设：MdPDE1是否通过调控cAMP信号来维持ROS稳态？

构建MdPDE1缺失突变体（mdpde1，cAMP升高）和过表达（MdPDE1，cAMP降低）水稻株系，野生型对照，高温和正常条件处理，观察株系的存活率、植物形态、组织化学染色、氧化损伤量等指标，发现mdpde1可增加ROS积累，降低水稻耐热性。分析mdpde1-vs-野生型在高温和正常条件下的转录组数据，发现mdpde1中抗氧化基因下调，表明cAMP可负调控ROS防御。随后结合qPCR、Western blot、遗传互作等实验证实核内cAMP降低可激活核内转录过程，上调ROS清除基因，进而降低核内ROS积累，避免热胁迫下细胞核内ROS的积累和耐热性降低。

在揭示了水稻耐热分子机制（TT2低表达→DGK7激酶活性增加→PA增加→MdPDE1积累→cAMP下降→耐热性增加）后，能否通过遗传改造信号模块，在田间条件下培养出具有不同耐热等级且无产量代谢的作物品种？

采用单基因过表达和多基因组合两种策略创制4类转基因水稻株系：DGK7过表达系（DGK7^OE/HJX、DGK7^OE/ NIL-TT2^HPS32）、MdPDE1过表达系（MdPDE1^OE/ZH11、MdPDE1^OE/NIL-TT2^HPS32）、TT2/DGK7双过表达株系、野生型株系（HJX、NIL-TT2^HPS32、ZH11）。在整个生殖发育阶段热胁迫处理4类转基因水稻株系，通过分析植物形态、产量、花粉活力、籽粒品质等指标，发现所有转基因系在正常条件下无产量损失，株型无异常。同时，单基因突变株系如：过表达DGK7或MdPDE1，可在轻度热害频发地使用，不影响株型和基础产量。DGK7过表达叠加TT2缺失的增产效果最佳，可增产108.67%，远高于单基因突变株系，适用于极端高温频发，粮食安全高风险区域。