Nat Immunol精选亮点文章 | 绘就脓毒症免疫作战地图！重医大曹炬/徐昉团队多组学全景解析脓毒症免疫异质性并锁定治疗新靶点！

单细胞转录组：108名成人，26名儿童的PBMC（外周血单核细胞），并进行成对的scTCR/scBCR测序；

CITE-SEQ：40名成人PBMC；

Bulk-mRNA：207患者的PBMC；

Olink炎症panel：214名血浆，包含不同感染部位来源的成人和儿童队列；

基于单细胞转录组、scTCR、scBCR数据，共解析出5个主要免疫谱系的44个高分辨率亚群。细胞比例分析发现，脓毒症以年龄依赖和感染来源依赖的方式改变免疫细胞组成，具体表现为：成人的CD4⁺T细胞频率在不同的脓毒症组之间没有差异，而儿童中患有脓毒症个体的CD4⁺T细胞频率降低。CD8⁺T细胞普遍下降，在患有腹部或尿路感染的成年人中尤为明显。无论什么感染源，成人和儿童的NK细胞都明显减少。

由于CD4⁺T细胞在成人群体中显著富集，作者将分析重点放在成人CD4⁺T细胞上。对CD4⁺T细胞进行进一步划分得到7种细胞亚群。生存分析发现，中央记忆T细胞：T_CD4_c02-GPR183-NR4A2中NR4A2的高表达与生存不良相关。

差异分析与GSVA分析表明：与良好预后有关的T_CD4_c03-GPR183-ANXA2细胞群相比，T_CD4_c02-GPR183-NR4A2中NR4A2、AREG和ARID5A表达上调，与细胞毒性和细胞因子相关的基因下调表达。CITE-SEQ显示T_CD4_c02-GPR183-NR4A2中共刺激分子（CD28、ICOS）减少，抑制受体（PD-L1，TIM-3）增加，表明细胞处于耗竭状态。结合拟时序分析，基因表达丰度热图，T_CD4_c02-GPR183-NR4A2细胞伴随凋亡、铁死亡和HIF-1途径的激活，疲劳/应急基因表达升高，NR4A2是脓毒症免疫衰竭的核心驱动因素，在免疫战场中举起了“投降的白旗”。

scTCR-seq（单细胞T细胞受体测序）表明：成人不同感染源的脓毒症患者存在共享和特有的免疫程序。如：T_CD4_c02_GPR183-NR4A2在腹部和皮肤感染源的脓毒症患者中存在明显的克隆性扩张。腹部和呼吸道队列人群的克隆型最多，而中枢神经系统病理与其他组的克隆型重叠最小。

建立两种遗传模型：Nr4a2敲除小鼠（Nr4a2-CKO）和过表达小鼠（Nr4a2-CKI），通过盲肠结扎穿刺术（CLP）和铜绿假单胞菌构建脓毒症模型。发现：NR4A2调节脓毒症中的CD4⁺T细胞病理，是一个潜在的治疗靶点。

成人脓毒症患者中发现CD8⁺ T细胞比例下调，对成人CD8⁺T细胞进行降维和聚类，发现7个亚群。其中终末分化效应记忆T细胞（TEMRA）群体可进一步分为两个分支：细胞毒性为主的T_CD8_c04-GNLY和促炎性的T_CD8_c05-GNLY-CCL4^hi。生存分析表明，T_CD8_c04-GNLY无预后价值，而T_CD8_c05-GNLY-CCL4^hi升高与预后不良相关。scTCR-seq，克隆扩张分析表明：T_CD8_C04-GNLY在组间没有显著差异，T_CD8_c05-GNLY-CCL4^hi在脓毒症中扩张增加。

5.1 成人B细胞亚群在不同感染源脓毒症人群中的异质性表达

B细胞亚群进一步划分为七个亚群，结合已发表的血液转录组数据，发现B细胞亚群存在不同功能。如下表： 

与健康对照相比，不同感染来源的成人B细胞亚群变化存在感染源异质性，如：

由于浆细胞存在显著扩增状态，使用BCR测序将浆细胞进一步分为IgG、IgM、IgA、IgD、IgE共5种亚型。结合免疫球蛋白重链可变区（IGHV）基因库分析，发现浆细胞在不同感染源脓毒症患者中也存在特异性分布。如：IgD浆细胞在呼吸道和皮肤感染中更为常见，IgE浆细胞几乎不存在。IGHM谱系中，IGHV1-8在呼吸感染患者中富集，IGHV1-69D在中枢神经系统脓毒症中富集，IGHV3-43在皮肤/软组织脓毒症中富集等。

5.2 CD14⁺⁺CD16^-单核细胞亚群在不同感染源脓毒症患者群体中的异常表达

检查单核细胞发现CD14⁺⁺CD16^-占单核细胞总数的75.9%，进一步将其分为5类。这5类单核细胞亚群存在独特的代谢特征，并在成人不同感染源的脓毒症患者中也存在特异性表达，如下表：

5.3 炎性NK细胞和NKT亚群在腹部和肺感染源的脓毒症患者中的表达

NK细胞可分为4个细胞亚群：

NKT细胞可分为6个细胞亚群：

为研究年龄依赖性的脓毒症感染具备的异质性。进一步比较成人和儿童脓毒症队列中PBMCs单细胞转录图谱。详细查看不同类型免疫细胞在成人和儿童中的差异性表达，发现单核细胞中，儿童存在一个成人没有的独特亚群：Mono_c06-CD14-MKI67，高表达MKI67、STMN1、MPO和Elane基因。GO富集表明，该亚群与氧化磷酸化、细胞周期、DNA复制和谷胱甘肽代谢有关，表明具有高增殖能力和活跃的代谢状态，潜在表明儿童特异性的紧急单核细胞反应，表明成人和儿童脓毒症的共性和独特的免疫图谱。

为研究具有不同感染源的脓毒症患者体内炎症介质的特征，通过Olink炎症panel阐明炎症和免疫调节蛋白在不同年龄和感染来源的脓毒症中共有和特有的表达模式，发现不同感染源脓毒症患者存在共享和特有的蛋白表达模式。如：共性层面表现为：有13种细胞因子和趋化因子在所有脓毒症感染源中持续上调。其中CCL3、CCL4和肿瘤坏死因子的表达水平在多种脓毒症亚型中显著升高，与上文单细胞分析中确定的特定促炎细胞亚群的标志物一致。TRAIL、SCF和TRANCE在内的六种蛋白在所有脓毒症感染源中持续下调。

特异性表现为：泌尿系感染性脓毒症中，uPA、CXCL11、IL-20RA和CD5的表达特异性上调；腹部脓毒症中CCL25特异性下调。不同感染源的儿童脓毒症人群血浆蛋白表达谱变化趋势与成人类似。

为再次验证本研究结果的可重复性，使用公开的scRNA-seq数据涵盖：脓毒症、COVID-19疫苗接种、DENV-1感染以及轻，中，重度SARS-CoV-2感染队列。Bulk转录组数据（涵盖：GAIN、MARS、儿科败血症队列）；包含122名成人和42名儿科患者的外部验证队列，通过流式细胞术证实PBMC中免疫亚群的扩增，进一步支持免疫亚群在脓毒症期间增强的促炎效应潜能。

将多组学数据整合到统计框架中，对scRNA-seq、CITE-seq、scTCR/BCR库、Bulk RNA-seq和血浆蛋白质组的配对数据进行多组学因子分析（MOFA）。发现两个不同的多组学变异轴：一个是在腹部和呼吸道脓毒症中富集的促炎程序，由促炎亚群T_CD8_c05-GNLY_CCL4^hi、Mono_c02-CD14-IL1B、NK_c03-PRF1_CCL4^hi和NKT_c05-IFNG_CCL4^hi驱动。另一个是涉及细胞毒性、干扰素反应和抗原程度的在重症疾病中减弱的保护性免疫程序，由GNLY或GZMK的CD4⁺ T细胞和CD8⁺T细胞，以及Mono_c01-CD14-HLA-DRA单核细胞驱动。

该研究从多组学、大队列和多层次分析共同描绘了成人和儿童脓毒症的感染源依赖免疫计划，将脓毒症从一个模糊的“综合征”概念，拆解为可识别，可干预的分子事件链，为年龄依赖和感染源依赖的脓毒症患者标注了一份“叛军据点”和“秘密武器库”的作战地图。为了解免疫异质性和指导未来的精确免疫治疗提供了一个框架。