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干货分享 | 一级序列确证——UPLC质量肽图

2023-08-30
中科新生命
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UPLC质量肽图分析是蛋白质一级结构研究中极为重要的手段之一,不但可以比较重组与天然蛋白质结果之间的同一性,确认基因工程上游和下游处理过程中是否发生差错、重组产物中是否存在后转译化学修饰及未预期氨基酸的变异等,而且不同批次产品的肽谱比较可验证工艺过程的稳定性。因此,肽谱分析在生物医药产品质控中尤为重要。

实验仪器

高分辨质谱仪:XevoG2-XS QTof (Waters公司)

超高效液相色谱:UPLC (Acquity UPLCⅠ-Class) (Waters公司)

检测流程

供试品经酶解后进入UPLC,根据肽段不同保留时间进行分离,洗脱下来的肽段进入质谱进行检测。根据质谱检测器采集的质谱结果和数据分析软件,可以确认UPLC质量肽图中紫外吸收峰所对应的肽段。

肽图分析原理及流程:

结果展示:

BPI图谱

BPI色谱图通常显示保留时间在x轴上,以及相对丰度(通常是信号强度)在y轴上。峰的位置和高度可用于识别分子的保留时间和相对丰度。此图主要反映样品的色谱分离度、肽段信号强度(可以结合上样量判断样品酶解情况)、样品蛋白构成复杂程度等。

肽段通过色谱柱分离后,通常采用紫外(UV)检测器在波长200~230nm范围内检测,最常用的检测波长是214nm。结合质谱检测可对各色谱峰对应的肽段进行定性,确定特征肽段并在肽图谱中进行归属。

UV图谱标注图

肽段信息列表

通过肽段信息列表可以直观的查看检测到的肽段的保留时间、酶切位点信息、及肽段序列、分子量等信息。

常见问题解答

UPLC质量肽图,同一肽段出现不同的洗脱时间?

出现不同的洗脱时间,可能由于肽段有异构化现象,分子量一样,但是极性不同,所以会出现洗脱时间有一定的差异。另外有些可能是由于肽段的丰度较高,洗脱时间过长,出现一定的拖尾现象。

UPLC质量肽图,蛋白内切酶的自切峰会不会出现在肽谱图上?

蛋白内切酶的使用量是蛋白质的1/50,在质谱上基本不会对蛋白质的肽段峰产生影响。

UPLC质量肽图的实验重复性如何?能否做到样品和对照的比较?

重复性较好,能通过和标准对照品一同实验来比较一致性,主要是判断出峰数量和出峰时间的一致性。最好是样品和对照品一同酶解,一同进行液相检测。如果中间隔较长时间,且不是同一批酶解,可能会出现细小的差别。主要是酶解较难控制。