Nat Metab | “肠-肝轴”研究顶级思路！香港中文大学于君等揭示肠道TM6SF2保护代谢功能障碍相关脂肪性肝炎机制

小鼠；

宏基因组、代谢组、转录组、粪菌移植、免疫组化、共免疫沉淀等；

系统性Tm6sf2敲除（KO）小鼠被喂食正常食物（NC）或缺乏胆碱的高脂肪饮食（CD-HFD）。与野生型小鼠相比，饲喂NC的系统性KO小鼠表现出更严重的脂肪变性、氧化应激和肝损伤，CD-HFD喂养的系统性KO小鼠比CD-HFD野生型小鼠表现出更明显的脂肪性肝炎。

肝脏特异性Tm6sf2 KO （Tm6sf2∆Liver）小鼠与野生型小鼠Tm6sf2fl相比肝脏脂质积累明显增加。然而，饲喂NC和CD-HFD均未导致Tm6sf2∆Liver小鼠的MASH活性评分或脂质过氧化显著增加，这些表明，全身性Tm6sf2缺乏比肝脏特异性Tm6sf2缺乏具有更强的促脂肪肝作用，这意味着非肝脏Tm6sf2参与了MASH的发展。

对肠道上皮细胞（IEC）特异性Tm6sf2 KO（Tm6sf2ΔIEC），喂食NC。发现Tm6sf2ΔIEC小鼠在12月龄时观察到更严重的MASH，肝脏TNF水平上调，NF-κB活化增强，磷酸化-p65 NF-κB亚基增加，i -κB α降低，多种与MASH相关的途径被激活。

给Tm6sf2ΔIEC和对照小鼠补充CD-HFD2个月，Tm6sf2ΔIEC小鼠发生了更明显的脂肪性肝炎，肝脂质积累升高；用高脂高胆固醇（HFHC）饮食喂养发现Tm6sf2ΔIEC小鼠发生更严重的脂肪性肝炎，即肠道Tm6sf2缺乏在促进小鼠自发或饮食诱导的MASH发展中起关键作用。

饲喂NC或CD-HFD的Tm6sf2ΔIEC小鼠门静脉和肝脏LPS水平显著升高，透射电镜显示Tm6sf2ΔIEC小鼠肠细胞内连接异常，肠道黏附蛋白E-cadherin、紧密连接蛋白claudin3和occludin的表达均显著下调，这些发现表明肠道Tm6sf2缺乏可导致肠屏障功能障碍。

对Tm6sf2ΔIEC和对照小鼠的粪便样本进行了宏基因组测序。PCA显示，Tm6sf2ΔIEC与野生型小鼠的微生物群落差异显著。多种潜在致病菌在Tm6sf2ΔIEC小鼠体内显著富集，同时伴随保护性细菌缺失。

对Tm6sf2ΔIEC和对照小鼠的粪便、门静脉血清和肝脏组织进行非靶向代谢组学分析。PCA和PLS-DA显示，Tm6sf2ΔIEC和Tm6sf2fl野生型小鼠之间的代谢组谱存在显著差异。在所有差异代谢物中，LPA持续上调的最高代谢物。

粪便、门静脉血清和肝脏组织中的LPA水平与Lachnospiraceae, Porphyromonadaceae 和Alistipes呈正相关，而与Ruminococcaceae呈负相关。以及多种菌参与磷酸甘油酯转化为LPA前体，这些结果表明，在肠道Tm6sf2缺乏的情况下，这些富集的细菌可能产生LPA。

在体外实验中LPA处理显著诱导小鼠正常肝细胞的甘油三酯积累、脂质过氧化和炎症，将LPAR拮抗剂AM095应用于细胞，LPAR阻断显著逆转了LPA诱导的小鼠AML-12和人THLE-2细胞的脂质积累、脂质过氧化和炎症。这些表明肠道Tm6sf2缺乏改变了肠道微生物群，增加了LPA的产生，而LPA可以通过门静脉循环进入肝脏，促进MASH的发展。

从Tm6sf2ΔIEC和对照小鼠小肠中分离了原代IEC，对培养上清进行非靶向代谢组学分析发现，Tm6sf2ΔIEC和对照小鼠IECs分泌的代谢物有显著差异，游离脂肪酸是最主要的代谢物。通过银染色和质谱联用，发现FABP5是小鼠肠道组织中Tm6sf2的潜在相互作用伙伴，免疫共沉淀、微尺度热电泳实验、分子对接分析结果同样支持此结果。以及人结肠上皮细胞中过表达FABP5可消除TM6SF2 ko诱导的LCFA分泌。这些结果表明，肠道Tm6sf2缺乏阻断了Tm6sf2与FABP5的结合，进而促进了肠道上皮游离脂肪酸的分泌和脂质积累。

另外，FITC标记显示补充花生四烯酸或花生四烯酸显著增加了肠道通透性，表明它们有能力破坏肠屏障的完整性。这两种游离脂肪酸也会引起小鼠肠道微生物生态失调，使产生LPA的微生物明显富集。这些发现表明，tm6sf2缺失的IECs导致游离脂肪酸分泌增加，肠道屏障受损和肠道生态失调，从而促进LPA的生物合成，加速MASH的发展。

将Tm6sf2ΔIEC小鼠或Tm6sf2fl小鼠的粪便样本移植到喂食NC的无菌小鼠中。G-Tm6sf2ΔIEC小鼠在FMT后4个月的肝脏脂质积累和MASH活性评分明显高于G-Tm6sf2fl对照小鼠，肝脏甘油三酯含量和脂质过氧化也显著升高，同时内脏脂肪重量增加，促炎细胞因子的表达上调，证实了炎症的增强。评估无菌受体小鼠的肠道微生物群α-多样性没有差异，β-多样性方面存在显著差异。潜在致病菌在G-Tm6sf2ΔIEC小鼠中富集保护性微生物被耗尽。非靶向和靶向代谢组学发现G-Tm6sf2ΔIEC小鼠粪便和门静脉血清中的LPA水平升高。这些结果证实了肠道微生物群在介导肠道Tm6sf2缺乏症诱导的MASH发育中的重要性。

将Tm6sf2ΔIEC小鼠与对照野生型小鼠共住4个月，Tm6sf2ΔIE肠道微生物生态失调得到恢复，表现出改善的脂肪性肝炎，肝脏脂质积累，MASH活性评分和促炎细胞因子TNF和IL-6减少，活化巨噬细胞和M1促炎巨噬细胞的比例也显著降低。这些结果表明，针对肠道微生物群可有效对抗肠道Tm6sf2缺乏症诱导的MASH。

使用LPAR拮抗剂AM095治疗Tm6sf2ΔIEC小鼠6周。与对照相比，LPAR阻断显著降低了Tm6sf2ΔIEC小鼠的脂质积累、MASH活性评分、肝脏甘油三酯和脂质过氧化，AM095处理减轻了小鼠饮食诱导的脂肪积累、MASH活性评分和甘油三酯含量，而Brp-LPA显著逆转饮食诱导的MASH，降低了脂肪积累、MASH活性评分和甘油三酯含量。这些发现表明LPAR阻断是一种很有希望的治疗MASH的方法。